Лабораторные методы оценки устойчивости

18.01.2014

Как было уже отмечено, оценку устойчивости нужно проводить в условиях, приближенных к естественным, то есть в поле, саду и т.д., но в селекционной работе довольно часто испытание устойчивости проводят в искусственных условиях лаборатории, теплицы, вегетационного помещения. Ряд причин побуждает прибегать к этим методам оценки.
В первую очередь это касается оценки устойчивости к карантинным объектам, когда заражение в полевых условиях может повлечь распространение болезни за пределы инфицированного участка. Например, хорошо известная болезнь рак картофеля в настоящее время — объект внутреннего карантина на территории Российской Федерации. Испытание на устойчивость к раку ведут путем посадки клубней испытуемых сортов в вегетационные сосуды, заполненные инфицированной почвой. Кроме того, существует метод заражения возбудителем рака отдельных глазков клубней картофеля в условиях лаборатории или теплицы. Применение такого метода показало, что в таких условиях вполне возможно выявить высокую степень иммунности, гарантирующую непоражаемость картофеля раком в полевых условиях.
Второй причиной, побуждающей использовать лабораторные методы оценки устойчивости, является стремление провести ее в более ранние фазы развития растений, не дожидаясь, когда болезнь появится в природе. В этих случаях поражаемость молодых растений должна быть сопоставимой с реакцией на заражение взрослых растений. Так, фитофтороз картофеля обычно развивается в природной обстановке во второй половине вегетационного периода. Использование в селекции картофеля диких видов, особенно такого, как Solarium demissum, позволило получать гибриды, у которых устойчивость можно выявить во все фазы развития. Восприимчивые растения в благоприятных для развития фитофтороза условиях парников и теплиц поражаются болезнью и в ювенильном состоянии. Поэтому семена гибридов картофеля высевают в парниках и теплицах. В фазе 1...2 настоящих листьев сеянцы в течение нескольких дней заражают возбудителем фитофтороза. Многократное заражение вызывает гибель всех неустойчивых сеянцев, а сохраняющиеся здоровыми гибриды высаживают в поле для дальнейшей селекции. Используя меньшую инфекционную нагрузку, можно добиться сохранения и менее устойчивых сеянцев, но представляющих интерес для селекционера по другим хозяйственным и биологическим признакам.
Очень часто растения в молодом возрасте подвергают заражению патогенами, поражающими корневую систему и сосуды, то есть испытывают на устойчивость к болезням типа увядания. Эту операцию можно с успехом проводить, выращивая растения в растильнях в условиях лаборатории или теплицы.
Третьей причиной целесообразности применения лабораторных методов оценки устойчивости является то, что при использовании этих методов создается возможность проводить оценку устойчивости круглый год, ускоряя таким образом процесс селекции.
Немаловажный фактор, отражающий положительную сторону лабораторных методов оценки устойчивости, — высокая производительность труда, снижение материальных затрат и уменьшение времени, которые потребовались бы при оценке в полевых условиях. Ряд примеров может служить иллюстрацией пользы применения лабораторных методов. В последнее время широкое распространение при оценке на устойчивость получил так называемый метод отделенных листьев, или бензимидазольный метод. Суть его заключается в том, что водный раствор бензимидазола слабой концентрации позволяет длительное время сохранять жизнеспособность отделенных от растения листьев (или даже их отрезков), помещенных в раствор. Для приготовления маточного раствора 1 г бензимидазола растворяют в 1 л дистиллированной воды и хранят в стеклянной посуде темного цвета в прохладном месте. Рабочий раствор готовят из расчета 0,06 л маточного на 1 л воды. Рабочим раствором пропитывают до насыщения какой-либо хорошо удерживающий влагу материал (фильтровальная бумага, марля, вата, перлит и т. п.), разложенный в кюветы, кристаллизаторы или чашки Петри, что зависит от количества и размера оцениваемого материала. Отделенные листья, доли листа, отрезки листьев или высечки из них, а иногда пасынки растений размещают на пропитанном материале так, чтобы через черешки, стебли или просто через поверхность листовой пластинки происходила подпитка водным раствором тканей растительного материала. Отделенные листья инокулируют способом, соответствующим виду культуры и возбудителю, а затем кюветы размещают под световые установки в лаборатории с регулируемым температурным режимом. В случае необходимости создания повышенной влажности на период заражения в кюветах, кристаллизаторах или чашках Петри создают условия влажной камеры (рис. 43).

Этот метод широко применяют при оценке устойчивости злаковых культур к мучнистой росе, ржавчине; томата к фитофторозу, альтернариозу, кладоспориозу, серой гнили; картофеля к фитофторозу и альтернариозу; огурца к пероноспорозу, мучнистой росе, антракнозу, аскохитозу, оливковой пятнистости и многих других культур к болезням, подобным названным. Положительная сторона этого метода состоит в том, что за короткий срок на небольшой площади представляется возможность сравнительной оценки большого количества селекционного материала. Обычно этот метод применяют в процессе предварительной оценки устойчивости.
Недостаток метода в том, что отделенные от растения листья не обладают тем уровнем устойчивости, который характерен для интактного растения; целый ряд механизмов устойчивости на отделенных листьях проявляется явно слабее. Раствор бензимидазола позволяет поддерживать жизнеспособность отделенных листьев в регулируемом температурном и световом режиме в течение 1...15 сут. Продолжительность этого периода зависит от вида оцениваемой культуры: обычно растения, относящиеся к классу однодольных, сохраняют жизнеспособность в течение более длительного времени. Период сохранения жизнеспособности отделенных листьев сокращается независимо от оцениваемой культуры, если инкубация после заражения осуществляется при более высоких температурах (выше 15...18° С) или недостаточном освещении. Это следует учитывать при организации работ по оценке устойчивости методом отделенных листьев. При соблюдении оптимальных для этого метода режимов можно четко выявить реакцию оцениваемого материала на устойчивость.
В лабораторных условиях часто ведут оценку устойчивости клубней и корнеплодов к ряду заболеваний, причем в процессе ее осуществления заражают как интактные органы, так и вырезки или высечки из них. Вот как оценивают устойчивость клубней картофеля к фитофторозу. Убранные клубни отмывают от почвы, дезинфицируют их поверхность, после чего погружают их на 15 мин в водную суспензию зооспорангиев или зооспор Ph. infestans. Затем инокулированные клубни укладывают в деревянные ящики, пересыпая влажными опилками, и покрывают сверху мокрой мешковиной. В таком состоянии клубни инкубируют в течение 2 нед при температуре 15...18° С.
Можно также нарезать из промытых и обеззараженных клубней ломтики толщиной 1...1,5 см и нанести на срезанную поверхность капли суспензии спор возбудителя фитофтороза нужной концентрации. Ломтики укладывают в чашки Петри и инкубируют в течение З...4 сут. О степени устойчивости судят по размерам некротических пятен и интенсивности спороношения, образующегося на поверхности ломтиков.
Об устойчивости корнеплодов моркови к белой и серой гнилям судят по интенсивности роста мицелия грибов Sclerotinia sclerotiorum и Botrytis сіnerea на ломтиках корнеплодов. Но этому предшествует довольно тщательная подготовка корнеплодов для заражения и размножение возбудителей болезней. Грибы размножают и выращивают на отжатом из корнеплодов и простерилизованном соке. Корнеплоды после уборки хранят в песке в прохладном месте. Перед оценкой на устойчивость их промывают в воде и подсушивают в условиях лаборатории. От нижней части каждого корнеплода отрезают кусок длиной 4 см. В чашки Петри кладут 3 диска фильтровальной бумаги, а на них помещают 3...4 тонкие деревянные палочки. Подготовленные таким образом чашки стерилизуют при температуре 130° С в течение 2 ч. После стерилизации в чашки наливают по 3 мл стерильной воды, куски корнеплодов разрезают вдоль и укладывают в чашки на деревянные палочки. Инокуляцию проводят выращенным мицелием возбудителя с помощью стерильной препаровальной иглы. На каждый кусок корнеплода инокулюм наносят в четырех местах. После этого чашки Петри инкубируют в термостате при температуре 24° С. Оценку на пораженность проводят трижды с интервалом 3 сут.
К лабораторным методам оценки прибегают в процессе селекции плодовых культур. Здесь наибольшее значение придают оценке молодых растений, так как заражение взрослых — трудоемкая процедура, результаты которой приходится ожидать довольно долго. Обычно оценке подвергают сеянцы или саженцы в возрасте 1...2 лет в расположенных в теплицах специальных камерах, в которых можно поддерживать заданные параметры окружающей среды.
Итак, лабораторные методы оценки устойчивости менее трудоемки по сравнению с полевой оценкой на искусственном инфекционном фоне и позволяют проанализировать большой по объему селекционный материал. Их можно применять в течение всего года и довольно часто еще до посева или посадки культуры в полевых условиях. Они позволяют значительно сократить число растений, подлежащих оценке на устойчивость. Поэтому при планировании селекционной программы на устойчивость растений к болезням эти методы должны занять свое место и постоянно совершенствоваться, чтобы приблизиться по достоверности результатов к получаемым в полевых условиях.