Электронный микроскоп

10.01.2014

Электронная микроскопия является методом, позволяющим при помощи электронного микроскопа, обладающего большой разрешающей способностью, получать значительное увеличение изображений при использовании источника света в виде пучка движущихся электронов.

В настоящее время известно несколько моделей электронных микроскопов. Имея общую принципиальную схему, они различаются между собой по ряду особенностей. В зависимости от разрешающей способности эти микроскопы делятся на приборы с малым, средним и большим разрешением.
Принцип использования электронной микроскопии микроорганизмов не отличается от общих принципов и особенность его заключается лишь в применении отдельных специфических приемов, касающихся процессов препарирования объектов и трактовки полученных результатов.
Изучение препаратов в электронном микроскопе дает возможность прежде всего получить наиболее точную информацию о размерах и форме испытуемого объекта. Полезное увеличение такого микроскопа достигает 100000. Кроме того, электронный микроскоп позволяет обнаружить мельчайшие детали в общем строении объекта и его составных частей, определить топографические взаимоотношения не только между различными частями самого объекта, но и частями прилегающих к нему других объектов.
Подробное изложение конструкции и правил эксплуатации электронных микроскопов дается в описаниях, прилагаемых обычно к каждому прибору. Названия отдельных узлов микроскопа характерны для любой модели.
1. Колонна микроскопа, являющаяся основной частью прибора. В ней имеются осветительная система, устройства, фокусирующие пучок электронов (линзы), камера объекта, экран и фотокамера. Количество линз доходит иногда до пяти.
2. Вакуумная система, при помощи которой создается необходимый вакуум (10в-4-10в-5 мм рт. ст.) в колонне.
3. Стенд микроскопа - подставка, на которой укрепляется колонна. В стенде располагается вакуумная система.
4. Питающее устройство, обеспечивающее напряжение анода, напряжение для питания линз и катода.
5. Вспомогательные устройства, состоящие из приспособлений для подъема колонны, заземления и т. д.
Препараты, предназначенные для электронной микроскопии, должны отвечать следующим требованиям.
1. Необходимо, чтобы они были сухими. Пары воды, выделяемые необезвоженным объектом, могут изменить давление в пространстве на пути пучка электронов и вызвать его рассеивание, потерю в разрешении деталей и снижение контрастности.
2. Толщина объекта вместе с подложкой не должна превышать примерно 0,25 мк. При толщине препарата свыше 0,25 мк происходит заметная потеря энергии электронов, снижается разрешающая способность прибора, а в результате нагревания объекта вызываются различные изменения в его структуре.
3. В препарате должны отсутствовать посторонние частицы.
4. Объекты должны подготавливаться таким образом, чтобы в поле зрения была исключена густота и нагроможденность в расположении исследуемых частиц.
5. Объекты должны быть достаточно контрастными.
Приготовление электронномикроскопических препаратов производится по такой схеме:
1. Приготовление подложек, соответствующих по своему назначению предметным стеклам в световой микроскопии и укрепленных на дисках из густой металлической сетки, содержащей 100 ячеек на 1 мм2.
2. Приготовление взвесей, очистка и концентрация объектов и нанесение их на подложки.
3. Высушивание объектов.
4. Контрастирование объектов.
Подложки должны быть достаточно тонкими и прочными. Широкое распространение получили подложки из коллодия и формвара (поливинил-формола). Легче всего приготовить подложки из коллодия. При помощи пастеровской пипетки каплю 1-1,5%-ного раствора нитроклетчатки в амилацетате осторожно опускают на поверхность дистиллированной воды, налитой в чашку Петри до 2/3 ее объема. После растекания капли амилацетат испаряется, а на поверхности воды остается тонкая (100-200 А) коллодиевая пленка, хорошо заметная на темном фоне. Затем при помощи тонко оттянутой пипетки наносят на различные участки пленки восемь-десять капель с исследуемым материалом. После этого кусочек металлической сетки, зажатый за угол пинцетом, подводят в глубине воды под участок с капельками и осторожно ее приподнимают. Пленка прилипает к сетке, извлекается из воды и высушивается, а затем на месте высохших капель вырезают диски величиной, равной диаметру патрона объектодержателя.
Можно приготовить подложки и другим способом. 12-14 готовых уже дисков из металлической сетки раскладывают двумя параллельными рядами на поверхности пленки, плавающей на воде. Затем, опуская чистое предметное стекло на сетки, погружают их в воду, быстро переворачивают их и извлекают наружу. В результате диски с пленками на них оказываются сверху стекла. После высушивания они легко отстают от стекла.
Подложки из формвара получают следующим образом. Каплю 0,25%-ного раствора формвара в двухлористом этилене опускают на поверхность воды, подогретой до 60° С. Вокруг капли, примерно на расстоянии 5 мм, образуется очень тонкая пленка, на которой раскладывают диски-носители, а затем поступают так, как и при изготовлении коллодиевой пленки.
Для очистки суспензии бактерий, подлежащих электронной микроскопии, предложен ряд методов. Среди них наиболее общеупотребительными являются центрифугирование и фильтрация. Очистку взвесей бактерий при помощи центрифугирования производят вначале при малых скоростях для удаления более крупных посторонних частиц. При повторном центрифугировании скорость увеличивают, получая в конечном итоге оса-
док, состоящий из бактерий. Этот осадок разводят в физиологическом растворе либо в дистиллированной воде до заметной опалесценции и полученную взвесь наносят в виде капель на подложку. При этом надо стремиться к тому, чтобы концентрация бактерий обеспечила равномерное распределение их на подложке и эффективное использование полей зрения.
Для освобождения бактерий от солей применяется метод капельного диализа либо диализ на мембранных ультрафильтрах. При капельном диализе в стерильную чашку Петри наливают 50 мл стерильной дистиллированной воды и прибавляют одну каплю чистого 2%-ного раствора коллодия или целлулоидина в амилацетате. На пленку, образовавшуюся на поверхности воды после испарения амилацетата, кладут сеточки и наносят на них по 0,1 мл суспензии бактерий. Чашку выдерживают в термостате при 25° С до полного окончания диализа. Время диализа зависит главным образом от состава питательной среды, на которой выращивались бактерии, а также от температуры, при которой этот диализ производился. В конце диализа при помощи чистой проволочной петли из чашки извлекают кусочек пленки с находящейся на ней сеточкой, немного поднимая и образуя вокруг петли пленку. Оставшуюся на петле пленку с сеткой подсушивают, отделяют от петли и помещают на предметный столик электронного микроскопа.
Метод диализа на мембранных ультрафильтрах, по Г. П. Павловскому (1953), заключается в том, что мембранные ультрафильтры, на которых помещены сетки с пленкой, опускают на поверхность дистиллированной воды в кристаллизатор, а на пленку наносят одну-две капли диализируемой бактериальной взвеси. Диализ длится 18-20 час. Каждую сеточку с пленкой и объектом после этого переносят в термостат и подсушивают, затем отделяют от фильтра и микроскопируют.
В практике электронной микроскопии в последнее время стал применяться метод так называемых теневых покрытий с целью получения более контрастных изображений. Заключается он в том, что в условиях вакуума на объект наносят в результате испарения тонкий слой металла - золота или хрома. Производят это таким образом: препарат укрепляют на некотором расстоянии от спирали из вольфрамовой проволоки (0,3 мм в диаметре). В спираль помещают 4 мг металла и после достижения вакуума (10в-4-10в-5 мм рт. ст.) распылитель накаливают током. Пары металла начинают покрывать тонким слоем обращенную к испарителю сторону объекта. Напыление, идущее под небольшим углом, распределяется неравномерно по всему объекту и зависит от структуры поверхности самого объекта. Так, участки, расположенные перпендикулярно к молекулярному пучку, покроются наибольшим слоем, а расположенные под острым углом - наименьшим. В местах, защищенных от попадания металла, т. е. находящихся в «тени», металлической пленки совсем не будут. Это неравномерное распределение металла дает неодинаковое рассеяние электронов, в связи с чем изображение в электронном микроскопе получится более контрастным.
Кроме указанных металлов могут быть использованы еще палладий, платина, уран, но, по мнению Андерсена (1956), хром для затенения объектов является наиболее целесообразным, так как он не способен к кристаллизации. В качестве напыляющих средств могут быть использованы и некоторые сплавы: золото-палладиевые, золото-манганиловые и другие, дающие бесструктурные пленки.
Несмотря на то, что метод напыления имеет очень большое значение в электронной микроскопии, нельзя не указать на некоторые его недостатки. Так, оттенение, способствуя выявлению грубой структуры подложки, мешает в то же время рассмотрению тонкой структуры объекта. Создавая условия для изучения рельефа поверхности объекта, метод ограничивает возможности изучения внутренней структуры. Таким образом, методом оттенения металлами следует пользоваться осторожно в зависимости от характера объекта.
Для высушивания объектов также используется ряд методов: высушивание на воздухе, метод критической точки температуры, замораживание и замораживание с предварительной химической фиксацией.