Универсальный прибор «УЭФ» для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков

10.01.2014

«УЭФ» представляет собой настольный лабораторный прибор, предназначенный для разделения животных, растительных, бактериальных и других белков на отдельные фракции на агар- агаре, бумаге и крахмале. Прибор состоит из стабилизированного выпрямителя, камеры для иммуноэлектрофореза с электродами из платины и нержавеющей стали и принадлежностей - кюветы с лотками для электрофореза на крахмале, рамок для помещения предметных стекол при иммуноэлектрофорезе на агар-агаре, лотков для электрофореза на бумаге, штатива для сушки бумажных полос в термостате, держателя рамки, нивелировочного столика для покрытия стекол агар-агаром, плашки с резцами для образования мелобов на агар-агаре, сифонной трубки для выравнивания буферного раствора в ваннах.
Разделение белков в приборе производят методом зонального электрофореза, проводимого с использованием так называемых носителей (фильтровальная бумага, агаровый гель, крахмал и др.).
Прибором «УЭФ» можно проводить исследования комбинированным методом электрофоретического и иммунологического фракционирования белков (иммуноэлектрофорез).
Электрофоретический метод на бумаге применяют для разделения и количественного определения белковых фракций сыворотки крови. Для этого используют буферный раствор (20,72 г мединала, 1 л дистиллированной воды и 148 мл 0,1-н. НСl). Хорошие результаты получают на хроматографической бумаге ленинградского производства. Исследования лучше проводить при температуре 3-10° С, но возможно и при комнатной температуре (18-20° С). Полученные на фильтровальной бумаге электрофореграммы окрашивают различными веществами: бромфеноловым синим, амидочерным, азокармином Б.
Содержание отдельных белковых фракций устанавливают методом элюирования с дальнейшим фотометрированием.
Метод электрофореза на крахмале используют с целью определения различных видов липидов (холестерина, жирных кислот, фосфатидов и др.) в отдельных белковых фракциях. Крахмальный блок готовят, размешивая картофельную муку с буферным раствором (мединала 10,3 г, веронала 1,84 г, дистиллированной воды 1 л) и накладывая его в лоток толщиной 8-10 мм. По окончании электрофореза получают «отпечаток», накладывая на крахмал фильтровальную бумагу, которая впитывает буферный раствор и разделенные фракции белка. Полученный отпечаток высушивают и окрашивают, что дает возможность определить расположение белковых фракции на крахмале, которое элюируют при помощи буферного раствора.
Метод иммуноэлектрофореза состоит из двух этапов: электрофоретического разделения белковых фракций изучаемого материала на агаре и выявления линий преципитации, образующихся в результате диффундирования антисывороток в агар и взаимодействия их с соответствующими белковыми фракциями.
Агар-агар для иммуноэлектрофореза готовится таким образом: его нарезают мелкими кусочками и заливают дистиллированной водой на 24 час, затем нагревают в водяной бане до расплавления. Не доводя до кипения, фильтруют в кристаллизаторе, охлаждают и нарезают мелкими кусочками, которые промывают в течение 72 час. 15 г высушенного агар-агара заливают 1 л буферного раствора (мединала 8,76 г, веронала 1,38 г и дистиллированной воды до 1 л) и выдерживают сутки.
Расплавляют в водяной бане и фильтруют в горячем состоянии.
После окончания электрофореза в агаре перпендикулярно линиям расположения белковых фракций вырезают узкие желобки, в которые наливают антисыворотку. Рамки с агар-агаром помещают во влажную камеру на 18 час при комнатной температуре.
С целью вымывания несвязанных белков рамки с иммунофореграммами погружают в физиологический раствор. Фиксацию иммунофореграмм осуществляют погружением рамок с агаром на 3 час в раствор спирта с глицерином (85 мл 60%-ного спирта + 15% чистого глицерина). Окраску зон преципитации проводят в течение 2-3 час красителями - амидочерным или азокармином.