Методы анализа семян

11.01.2014

Наряду с основными требованиями к посевному материалу в отношении чистоты, всхожести, полновесности зерна крайне важно проведение контроля его на зараженность возбудителями бактериальных болезней. Как известно, передача этих бактерий семенами является одним из способов распространения бактериозов растений в природе и заноса их на поля, отведенные под новый урожай. Вот почему предварительная проверка и контроль семян на присутствие на них фитопатогенных бактерий является мероприятием, равноценным определению энергии прорастания и всхожести, сортовой чистоты и других признаков.
Определение зараженности семян бактериями представляет собой один из первоначальных этапов осуществления семенного контроля. Методы фитопатологической экспертизы семян вначале были очень мало дифференцированы, но с течением времени в результате исследований, проведенных в Советском Союзе и в зарубежных странах, были разработаны самые разнообразные методы анализа семян на их зараженность возбудителями болезней.
Метод наружного осмотра семян. Метод наружного осмотра семян представляет собой один из самых простых приемов фитопатологической экспертизы семян на зараженность их болезнями. Основан он на том факте, что у пораженных семян болезнь может вызывать появление определенных признаков, отличающих их по внешнему виду от здоровых, например щуплость, недоразвитость, искривление, потускнение кожуры, пятна и язвы разной окраски на ее поверхности и др. При осмотре сухих семян при помощи лупы все эти изменения легко обнаружить. В некоторых случаях эти патологические изменения имеют настолько характерный вид, что уже на их основании можно определить, возбудителем какого бактериоза бывают заражены такие семена. Таковы, например, бактериозы фасоли, черный бактериоз пшеницы и др.
Метод промывания семян с дальнейшим центрифугированием. Метод промывания семян с дальнейшим центрифугированием промывных вод и их просмотр под микроскопом применяется главным образом для определения поверхностной зараженности, семян такими бактериями, морфологические признаки которых являются настолько характерными, что они могут быть основанием для определения их принадлежности к определенному виду бактерий. К числу таких бактерий относятся в основном грамположительные палочки типа Corynebacierium и спороносные бактерии. Однако метод этот нуждается в дальнейшем бактериологическом подтверждении.
Метод влажной камеры. Для влажной камеры применяются хорошо промытые сухие чашки Петри или фаянсовые растильни, на дно которых кладут марлю в три слоя либо два слоя фильтровальной бумаги, положенной на гигроскопическую вату толщиной 0,25 см. Все материалы, применяющиеся для анализа семян на болезни, должны быть стерильными.
Чашки Петри с вложенной в них марлей, фильтровальной бумагой и ватой стерилизуют в сушильном шкафу при 130° С два часа, либо в автоклаве при 2 атм 30–40 мин. Растильни обезвреживаются смоченным в спирте и зажженным квачом. Все другие применяемые в этой работе мелкие металлические предметы (как пинцеты, ланцеты, иглы) опускают в спирт и затем стерилизуют на пламени горелки. Подстилки из ваты, фильтровальной бумаги в чашках Петри и растильнях смачиваются стерильной водой таким образом, чтобы не было ее избытка.
Для анализа крупных семян: сои, фасоли, гороха и других используют чашки Коха, фаянсовые растильни или тарелки, насыпая в них обыкновенный речной песок, предварительно просеянный через сито с отверстиями в 1 мл, промытый водой, прокаленный и увлажненный затем стерильной или свежекипяченой водой. Песок увлажняется обычно на 80% от полной влагоемкости.
После того как подготовлена вся посуда, приступают к раскладке семян, которая должна производиться с соблюдением всех правил, обеспечивающих невозможность попадания на семена из воздуха и окружающих предметов микрофлоры, могущей вызвать их заражение. С этой целью воздух комнаты обрабатывают раствором лизола, дезинфицируют рабочее место и все предметы, подлежащие употреблению, запрещается хождение по комнате во избежание движения воздуха и др.
Чашки Петри, Коха или фаянсовые растильни с разложенными в них семенами помещают в термостат при температуре, указанной в ГОСТе – 12038–66 для различных сельскохозяйственных культур, т. е. от 20 до 30° С. Температура в термостате должна поддерживаться на требуемом уровне круглосуточно. Учет энергии прорастания и всхожести семян производятся в дни, указанные в ГОСТе. В этот же период времени ведутся наблюдения и за проявлением пораженности семян и проростков бактериями.
В соответствии с ГОСТом заражение семян болезнями определяют только один раз по истечении установленного срока их проращивания, учитывая количество семян, пораженных отдельными видами болезней и общее количество больных семян по каждому повторению. Средний процент вычисляют из результатов анализа всех повторений. Однако приведенная в ГОСТе методика учета пораженности семян бактериозами не является удовлетворительной и требует внесения определенных изменений.
Прежде всего следует отметить, что при определении бактериальных поражений в конце установленного срока проведения фитопатологической экспертизы эти заболевания могут и не быть обнаружены. В некоторых случаях пораженность семян бактериями бывает достаточно четко заметна уже на второй- третий день и может быть установлена на основании появления на них капель мутной жидкости (экссудат) разной окраски, либо по их полному ослизнению. Но иногда такие признаки быстро исчезают в связи с подсыханием капель экссудата, и тогда бактериоз трудно заметить. Семена, сильно пораженные бактериозом, как правило, загнивают и не прорастают. Пораженность таких семян бактериями обнаруживается обычно при их раздавливании. Кроме того, бывают случаи, когда внешне на семенах нет признаков бактериальных поражений. Однако благодаря наличию внутренней инфекции из них вырастают проростки, пораженные бактериозом, проявляющимся в наличии пятен на семядолях, в стекловидности стебелька и корешков, мокрой гнили стебельков и корешков и других поражений. Все это необходимо иметь в виду при подсчете результатов фитопатологического анализа семян.
Следует при этом подчеркнуть, что для того чтобы такой учет сделать наиболее достоверным, необходимо подтвердить полученные цифры бактериологическим анализом, так как наличие экссудата на семенах еще не свидетельствует о том, что он вызван деятельностью патогенных бактерий. С этой целью выступившие на семенах капли бактериальной слизи, а также отдельные части пораженных проростков высевают на твердые питательные среды для изолирования возбудителя. После того как на таких средах появились бактериальные колонии, от них отсевают культуры бактерий на агаровые косяки и изучают их биологические свойства для определения их видовой принадлежности.
Проращивание семян в пробирках с песком или на других подстилках. Пробирочный метод определения зараженности семян бактериозами может быть широко использован в лабораторной практике. Особенно большое значение он имеет в том случае, когда бывает необходимо определить внутреннюю зараженность семян.
Следует отметить, что при помощи этого метода можно определять не только зараженность семян, но и ее степень, а также диагностировать возбудителя заболевания. Примером может служить установление зараженности семян хлопчатника возбудителем гомоза (X. malvaceorum). Чтобы выявить зараженность семян, их проращивают в оптимальных условиях температуры и влажности по 200–400–600 шт. на вариант, которые высеваются в простерилизованные пробирки с влажным песком либо влажной фильтровальной бумагой или марлей.
Пробирки с песком готовятся таким образом. Хорошо промытый увлажненный песок насыпают в широкие пробирки на 1/4 высоты (высота пробирок 200–220 мм), закрывая пробкой и стерилизуя их в автоклаве при 2 атм (121° С) в течение 40 мин. Затем в каждую пробирку высевают по одному семени. После посева пробирки помещают для прорастания в термостат со специальным световым и температурным режимом и следят за проявлением бактериоза на проростках, подсчитывая их количество два-три раза в течение двух-трех недель. В конце опыта определяют общий процент пораженности гоммозом. Этот метод фитопатологической экспертизы особенно удобен для выявления внутренней зараженности семян возбудителями бактериозов. При этом для уничтожения наружной инфекции на семенах перед посевом их подвергают различным методам обеззараживания. Так, для уничтожения поверхностной инфекции семян хлопчатника гоммозом рекомендуются: обработка семян крепкой серной кислотой в течение 30 мин, а затем 0,1%-ным раствором сулемы – 2 мин; обработка семян тем же способом, но с заменой растворов сулемы обжиганием семян спиртом; обеззараживание семян раствором формалина 1 : 100 в течение 5 мин + томление в течение 3 час; обработка семян раствором сулемы (1 : 3000) в течение 3–5 мин с дальнейшей промывкой стерильной водой и погружением в 96°-ный спирт для отмывания сулемы. Применение сулемы против поверхностной инфекции рекомендуется и при заражении другими бактериозами, например бактериальным раком томатов.
Однако если учесть, что сулема может убивать также внутреннюю инфекцию и плохо отмывается, меньшую опасность представляет обработка семян формалином, учитывая его слабое проникновение внутрь семян.
Бактериологический метод. Для выявления внутренней инфекции пользуются иногда бактериологическим методом. Для этого семена освобождают от поверхностного заражения, применяя различные приемы: погружение на 5 мин в 0,5%-ный раствор марганцевокислого калия (ГОСТ); погружение семян на 1 мин в 95–96°-ный спирт и дальнейшая просушка затем между листками стерильной фильтровальной бумаги (ГОСТ); замачивание семян в растворе формалина 1 : 100 в течение 5 мин и дальнейшее томление в течение 3 час; дезинфекция семян сулемой в концентрации 1 : 1000 в течение 1–2 мин или 1 : 3000 на 3 мин.
Семена погружают в эти растворы так, чтобы они не всплывали на поверхность. Затем стерильным пинцетом их переносят в стерильную чашку Петри со стерильной водой на 3–5 мин, все время покачивая ее, но не выплескивая через край. После этого семена погружают в 96°-ный спирт в стерильной чашке на 10 сек. Затем их быстро переносят в стерильную чашку со стерильной водой и отмывают в воде не менее трех-четырех раз в течение 3–5 мин, меняя каждый раз чашку Петри. Пинцет каждый раз после соприкосновения с семенами должен прокаливаться на огне и остуживаться в стерильной чашке.
После пяти-шестикратного промывания такие семена растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды. Полученную кашицу высевают затем на поверхность твердой питательной среды, переносят в термостат и выдерживают при соответствующей температуре и экспозиции. После этого чашки вынимают из термостата и из выросших колоний отвивают культуры бактерий, подвергая их в дальнейшем подробному изучению для определения вида бактерий. Следует отметить, что раскладывание целых семян непосредственно на питательные среды часто не дает удовлетворительных результатов, особенно при глубоком залегании инфекции в семенах.
Недостаточно эффективным является также способ посева семян в бульон Готтингера с дальнейшим высевом через 24–48 час мутной капли бульона на твердую питательную среду для выделения возбудителя бактериоза.
Люминесцентный метод. Применение люминесцентного метода при фитопатологической экспертизе семян дает возможность обнаружить внутреннюю зараженность семян и установить их недоброкачественность. При наличии пораженности семян микробами у них отсутствует свечение, темнеет оболочка. При люминесцентном методе используют прибор ОИ-18. Методика этого метода заключается в следующем: семена рассыпают или раскладывают в один ряд на фотографической бумаге или бархате, помещая их непосредственно под ртутно-кварцевой лампой. Расстояние между лампой и семенами должно быть предварительно отрегулировано (15–30 см). Через несколько секунд семена начинают ярко и ровно флюоресцировать, если они здоровы; если же они заражены, флюоресценция у них отсутствует, они кажутся темными и тусклыми.
Тушение флюоресценции связано с заражением семян не только патогенными бактериями, но и грибами, а также с низкой всхожестью семян и повышенной влажностью, с наличием на них сапрофитной микрофлоры. Так, семена гороха флуоресцируют голубовато-зеленым цветом, а места, пораженные аскохитозом и фузариозом, выступают тусклыми и коричневокрасными пятнами. На темной поверхности семян свеклы, пораженных грибом Phoma betae Franc., обнаруживаются точки, светящиеся белым матовым цветом. Они обозначают места нахождения поверхностных плодовых тел гриба.
Семена кукурузы, пораженные фузариозом, флуоресцируют ярким оранжевым или малиновым цветом в местах залегания гриба.
Следует иметь в виду, что люминесцентный метод можно применять на семенах только со светлоокрашенной оболочкой, так как семена с темноокрашенной кожурой не обладают флуоресценцией. Кроме того, флуоресценция может быть обусловлена и некоторыми такими случайными факторами, как механические повреждения семени, поражения насекомыми, загрязнение микробами, обладающими собственной флуоресценцией.
В качестве объектов для выявления флуоресценции могут быть использованы не только целые семена, а и сделанные из них срезы. При наличии заражения семян пшеницы грибами на срезах, сделанных из этих семян, можно отметить в межклетниках отчетливо выделяющийся мицелий гриба пыльной головни с характерными вздутиями на концах гиф. После пропитывания срезов эозином возникает вторичная флуоресценция у зародыша и эндосперма семян. Зародыш флуоресцирует зеленовато-желтым цветом, а клейковина – желтым. Щиток зародыша и алейроновый слой не флуоресцируют. Мицелий пыльной головни светится ярким канареечно-желтым цветом, а без окраски эозином – бледно-голубым.
Грунтконтроль, или полевой метод. Применяется обычно в тех случаях, когда видимые симптомы болезни проявляются на взрослых растениях. На зараженность семян указывает при этом изреженность всходов, а также пораженность их болезнью.
По своей простоте этот метод является наиболее доступным, однако для получения результатов надо затратить сравнительно много времени.
Серологический метод. Серологический метод определения зараженности семян бактериальными болезнями был разработан рядом советских ученых. Этим методом удается очень точно определить зараженность семян бактериозами. Приводим описание некоторых из разработанных методов.
В 1939 г. Т.И. Федотова и З.С. Касперович предложили так называемый ускоренный серологический метод определения зараженности семян. Он заключается в применении питательной среды, на которой развивались бактерии, как антигена, к которому добавлялась иммунная сыворотка. Если в этой среде находился возбудитель, то выпадал осадок, состоящий из склеенных бактерий. Титрование сыворотки дает возможность определить степень зараженности. При последовательном применении сывороток к разным возбудителям можно выяснить, какими бактериозами был заражен образец.
Для диагностики черного бактериоза пшеницы Д.Э. Беленький и Н.Н. Попова (1939) применили капельный метод, который состоял в том, что на предметном стекле смешивали каплю специфической сыворотки с чистой культурой бактерий – возбудителей болезни. При наличии реакции агглютинации на стекле было ясно заметно выпадение хлопьевидного или творожистого осадка.
Капельный метод агглютинации применяли также Р.М. Галачьян и Д.Я. Типограф (1940) для определения зараженности пшеницы бактериозом.
Анатомический метод. Применяется главным образом для выявления внутренней инфекции семян. Он состоит в микроскопировании срезов тканей семян, специально окрашенных и не окрашенных, и в определении в них локализации бактериальной инфекции. Метод трудоемкий и может применяться лишь при специальных исследованиях.
Метод определения зараженности семян по А. Лавриковичу и З. Клементу. А. Лаврикович и З. Клемент разработали практический метод для демонстрации зараженности семян фасоли возбудителями ее бактериозов: C.flaccumfaciens, X. phaseoli, P. phaseolicola. Заключается он в следующем. Поверхность семян стерилизуют азотистой кислотой, затем семена подсушивают, размалывают в муку и приготовляют из нее суспензию, которую центрифугируют. В результате этого частички муки оседают на дно, а бактерии, бывшие на семенах, остаются во взвешенном состоянии. Определенное количество суспензии засевают на поверхность питательного агара в чашки Петри, помещая их затем в термостат при 27° С. Колонии бактерий развиваются в течение 48–72 час. Полученные затем штаммы бактерий идентифицируют серологическим методом путем агглютинации иммунной сывороткой на стеклянных пластинках. Этим методом можно установить зараженность семян в том случае, если количество бактерий в 100 семенах составляет около 800.