Реакция питательных сред

31.01.2014

Питательные среды должны иметь определенную реакцию (pH), так как микробы хотя и могут приспосабливаться к некоторым ее колебаниям, но для каждого из них существуют определенные пределы, за которые эти колебания не должны переходить. При кислой реакции, как известно, происходит рост только некоторых бактерий, в то время как большинство из них хорошо растет обычно при щелочной реакции.
Как было уже указано, определение pH может производиться колориметрическим и электрометрическим методами. В обычной лабораторной практике это определение чаще всего делается при помощи колориметра с применением различных индикаторов. Надо отметать, что этот метод обладает некоторыми недостатками, в частности имеется затруднение при определении окрашенных сред. В связи с изменением цвета индикатора в зависимости от степени его диссоциации несколько искажаются и его показания. На результаты реакции влияет также наличие солей и самих индикаторов и т. д. Однако этот метод благодаря быстроте и несложности получил широкое распространение. Для грубого определения pH пользуются различными индикаторами.
Широко известна серия окрашенных индикаторов Кларка и Лэбса, при помощи которых можно определить изменение pH в пределах от 1,2 до 9,8. Ниже приводятся рабочие растворы Кларка и Лэбса.

Готовят эти индикаторы таким образом: по 0,1 г индикатора в порошке растирают в ступке с указанным ниже количеством едкого натра (NaOH), содержащего 2 г едкого натра в 1 л.

После растворения индикаторов объем их доводят водой до 25 мл, получая растворы с концентрацией 0,4%. Они хранятся на холоде как запасные. Рабочие растворы готовят, разбавляя основные водой; раствор крезолфталеина делается на спирту. Для получения рабочего раствора метилового красного к запасному раствору прибавляют сначала 60 мл дважды перегнанного спирта, а затем доводят водой до 500 мл.
В качестве стандартных растворов используют растворы химически чистых Na2НР04 • 2Н2О, содержащего в 1 л 11,876 г соли, и КН2РО4, содержащего в 1 л 9,078 г соли. Растворы смешивают в определенных соотношениях и затем прибавляют к ним и исследуемым растворам одинаковое количество индикаторов. На 5 мл раствора прибавляют две–пять капель индикатора.

Для бактериологической работы особенно интересны три индикатора, охватывающие ряды pH, близкие к нейтральному: бромкрезоловый пурпурный, бромтимоловый синий и феноловый красный. При этом наиболее точно показывает pH бромтимоловый синий. Он становится желтым в кислых растворах и синим – в щелочных, при pH 7,0 – смарагдового цвета (травянистого), который настолько характерен, что его легко отличить и при небольшом навыке.
Определенный интерес представляет также универсальный индикатор «ЗИВ-1». Применяется он для грубого определения pH в интервале от 2 до 10 с точностью до 1. Рабочий раствор готовится при помощи добавления содержимого ампулы к 100 мл 70%-ного этилового спирта. На 5 мл испытуемого раствора берут три-четыре капли индикатора. Окраска индикаторов изменяется следующим образом: при pH 2 – красно-розовый, pH 3 – красно-оранжевый, pH 4 – оранжевый, pH 5 – желто-оранжевый, pH 6 – лимонно-желтый, pH 7 – желто-зеленый, pH 8 – зеленый, pH 9 – сине-зеленый, pH 10 – фиолетовый.
Показания с точностью до 0,1 можно получить при определении pH по индикатору Н.И. Алимовского.
Определение pH среды колориметрическим методом производится при помощи компаратора.
Таким образом, для определения pH среды необходимо иметь такие реактивы и приборы: набор стандартов с растворами pH от 6,5 до 8,0; компоратор; микробюретки; бактериологические пипетки на 1 и 10 мл; растворы индикаторов, соответствующие стандартам; 0,05 молярный, или 0,2-н. раствор NaOH, который соответствует 0,2%- ному. Последний раствор легко получить из 0,1-н. NaOH, отмеряя 500 мл в литровую мерную колбу и доводя объем дистиллированной воды до 1000 мл.
Ход определения pH следующий. Необходимо получить среду с pH 7,4. Для этого приготовленную среду наливают в три пробирки (по Михаэлису по 6 мл), в одну из них прибавляют индикатор по Михаэлису – пара-нитрофенол в количестве 1 мл и ставят в первый ряд компаратора так, чтобы пробирка со средой и индикатором была посередине, а по бокам ее – пробирки со средой без индикатора. В боковые гнезда второго ряда, т. е. за пробирками без индикатора, ставят стандартные пробирки с pH 7,3–7,5 и за пробиркой, содержащей индикатор, пробирку с дистиллированной водой. Сравнивая оттенки стандартов и среды с индикатором, отмечают, является ли среда более кислой или более щелочной. Допустим, что цвет стандарта с pH 7,2 совпадает с цветом испытуемой среды. Следовательно, реакция более кислая, чем нужно. Тогда из микробюретки прибавляют небольшими порциями 0,2-н. NaOH до тех пор, пока цвет этой пробирки совпадет со стандартом 7,4. После прибавления щелочи содержимое пробирки перед тем, как ее сравнить, тщательно перемешивают. То же самое количество щелочи прибавляют и к пробиркам с чистой средой, чтобы компенсировать изменение цвета естественного пигмента среды или помутнение. Допустим, для того чтобы привести цвет пробирки, содержащей 5 мл среды, к тому цвету, который соответствует pH 7,4, потребовалось 0,32 мл 0,2-н. щелочи. Тогда, например, для 2 л среды потребуется 5 : 0,32 = 2000 : х, где х = 0,32 • 2000/5= 128, т. е. к 2 л среды нужно добавить 128 мл 0,2-н. щелочи или лучше 64 мл 0,1-н. или 6,4 мл 1-н.
Этот метод применяется для жидких сред. При наличии плотных сред поступают несколько иначе. Разжиженный агар и желатину разводят в семь раз, а затем производят колориметрические исследования.