Белковые среды

31.01.2014

Основными и общеупотребительными средами являются мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ) и мясопептонная желатина (МПЖ). Для приготовления этих сред используют мясную воду, которая служит хорошей питательной средой для ряда микроорганизмов.
Мясная вода. Мясо для приготовления мясной воды надо освободить от жира, костей и сухожилий и измельчить на мясорубке. К 500 г полученного фарша добавляют 1 л воды и оставляют экстрагироваться на 2 час в кастрюле при 37–39° С или же на 1 час при температуре 50° С. Мясной фарш можно выдерживать также 2–4 час при температуре, близкой к кипению. Затем настой кипятят 1 час, фильтруют и стерилизуют при 120° С 20 мин.
Мясопептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона и 5 г поваренной соли. Так как мясная вода благодаря наличию молочной кислоты имеет кислую реакцию, вредную для многих бактерий, среду подщелачивают при помощи насыщенного раствора углекислого натрия до слабощелочной реакции. Затем бульон кипятят в течение 30 мин.
Объем остывшего бульона доводят до 1 л и фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Если бульон окажется мутным, его осветляют белком одного яйца, смешанным с 40 мл воды и взбитым в пену. Осветлять бульон можно еще при помощи 30 г мясного фарша, растертого с 100 мл воды либо 20–30 мл сыворотки крови. Затем МПБ нагревают в автоклаве при 3/4 атм 20 мин. При оседании белки яйца, фарша и сыворотки увлекают и муть, которая потом при фильтровании остается на бумажном фильтре. Прозрачный бульон разливают в нужную посуду (пробирки, сотки, колбы) и стерилизуют в автоклаве при 120° С в течение 15–20 мин либо в аппарате Коха три дня подряд по 30 мин. МПБ можно приготовить также из мясных кубиков, но методика его изготовления будет нами приведена в разделе, посвященном сухим средам.
Основная мясная среда Готтингера. Исследованиями Готтингера было установлено, что применение мясной воды как основы для приготовления питательных сред является нерациональным, так как значительное количество ценных питательных веществ не попадает в среду, будучи абсорбированными свертывающимися белками после опускания мяса в кипящую воду.
Поэтому, чтобы использовать полнее питательные вещества мяса, Готтингер предложил подвергать его перевариванию при помощи панкреатина, в результате которого в жидкости образуются пептоны, полипептиды и аминокислоты. Переваривание мяса по Готтингеру сильно упрощает и удешевляет приготовление питательных сред. Мало того, наши наблюдения показали, что фитопатогенные бактерии быстрее и лучше растут и размножаются на бульоне Готтингера. Методика приготовления среды Готтингера такова: 0,5 кг мяса, нарезанного кусочками, кипятят в 1 л воды, затем мясо пропускают через мясорубку. Остывшую до 40–45° С жидкость переливают в бутыль, опускают туда фарш, прибавляют 50 г размельченной прджелудочной железы или 1% панкреатина, устанавливают через полчаса pH 7,7–8,0 и добавляют 2–3% хлороформа. Через 1–2 час снова проверяют pH, доводя его до 7,7–8,0, закрывают бутыль пробкой и ставят в теплое место. Переваривание ведут одну-две недели до тех пор, пока кусочки фарша не превратятся в гемогенный осадок, периодически хорошо взбалтывая жидкость. Затем ее кипятят до удаления хлороформа, фильтруют и стерилизуют при 120° С 20 мин. Из этого основного раствора готовят затем рабочий бульон Готтингера. Для этого его разводят водой пять–семь и даже десять раз, добавляют 5 г NaCl на каждый литр, подщелачивают до pH 7,2–7,4 и снова стерилизуют. Фитопатогенные бактерии на таком бульоне обычно хорошо растут.
Основная среда Готтингера по Саватееву. Учитывая некоторые недостатки методики изготовления среды по Готтингеру, Саватеев предложил свой видоизмененный метод. Практически он сводится к следующему: к 2 л кипящей дистиллированной или снеговой воды добавляют порциями мелко нарезанного или пропущенного через мясорубку 1 кг мяса (лошади, быка, барана, кролика). Нагревание прекращают, как только все мясо станет серым, т. е. когда свернутся белки. Когда среда остынет до 40° С, ее переливают в бутыль такой емкости, чтобы 1/3 ее осталась незаполненной. Затем прибавляют 10%-ную соду (примерно 150–200 мл на 2 л) для доведения реакции до pH 7,7–7,8, проверяя его реактивной бумажкой или по компаратору. После этого добавляют 20 мл желчи или 100 г пропущенной через мясорубку печени любого животного, а также активированный панкреатин. Последний готовится таким образом: 3 г панкреатина и 3 г высушенного соскоба слизистой оболочки тонких кишек, называющегося оропоном, разбалтывают в колбе со 150–200 мл дистиллированной воды, устанавливают pH 7,7–8,0 и помещают смесь в термостат при 37° С на 30 мин. Затем содержимое колбы переливают в бутыль со средой, хорошо встряхивают, добавляют 20–30 г хлороформа, плотно закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат при 37° С на пять–десять дней. Вместо панкреатина и оропона можно добавлять 60 г молотой свежей поджелудочной железы (коровы, лошади и других животных) и столовую ложку соскоба слизистой тонких кишек тех же животных. Во время переваривания бутыль несколько раз встряхивают, приоткрывая пробку для выхода паров хлороформа и проверяют реакцию, доводя ее в случае необходимости до pH 7,6–7,8. Через пять–десять дней мясо превращается в гемогенную массу, над которой находится совершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Готовность среды проверяют при помощи реакции при наличии триптофана. Для этого 2–3 мл отфильтрованной среды слегка подкисляют 2–5%-ным раствором уксусной кислоты и осторожно по каплям прибавляют бромную воду. При наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет. Бромная вода готовится добавлением брома к дистиллированной воде до выпадения его в осадок (на 100 мл воды нужно 3,66 г брома).
Полученную среду, не взбалтывая, фильтруют через складчатый бумажный фильтр, разливают в литровые бутылки, добавляют 10 мл хлороформа в каждую бутылку, закрывают резиновой пробкой и сохраняют при комнатной температуре, но лучше в темном и прохладном месте.
Для приготовления бульона берут 100 мл этой среды и 900 мл раствора из 3 г NaCl, 1 г Na2HPО4, 0,2 г КСl на 1 л воды. Полученный бульон нагревают до исчезновения запаха хлороформа, устанавливают нужную реакцию и дробно стерилизуют.
Мясопептонный агар (МПА). К 1 л мясопептонного бульона прибавляют 15–20 г агар-агара и нагревают до полного растворения, проверяют реакцию и затем фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осветления мясопептонного агара можно достигнуть, осаждая его в большой воронке, которая остается на несколько часов с агаром в теплом автоклаве, а затем остывает на холоде. После этого нижние слои агара срезают и удаляют. Прозрачный мясопептонный агар разливают в пробирки, флаконы или матрацы так, чтобы он не попадал на верхнюю часть посуды, куда вставляют пробку. Стерилизуют при температуре 120° С 15–30 мин. После стерилизации агару придают нужную форму – в пробирках его оставляют застывать столбиком либо скашивают. Скашивают агар и в матрацах. После остывания агар отдает конденсационную воду, собирающуюся внизу пробирки или матраца.
Мясопептонная желатина (МПЖ). К 1 л мясопептонного бульона или бульона Готтингера добавляют 10–15 г мелко нарезанной желатины и растворяют, нагревая на водяной бане при 40–50° С. Устанавливают pH 7,0– 7,2. Для осветления добавляют на 0,5 л среды один яичный белок, взбалтывают и подогревают в аппарате Коха в течение 20 мин при 100° С. Затем фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и подвергают дробной стерилизации три дня по 1 час при 100° С. Некоторые авторы рекомендуют стерилизовать желатину при 112° С в течение 10–15 мин. После такой стерилизации желатину выдерживают трое суток в термостате, а затем оставляют ее остывать столбиком в прохладном месте.
Свернутая сыворотка по Леффлеру. Смешивают три части кровяной сыворотки коровы или барана с одной частью нейтрального 1%-ного сахарного бульона с глюкозой, разливают в пробирки и чашки Петри и свертывают три дня подряд при 90–95° С в течение 2 час, постепенно повышая температуру. Для изготовления этой среды можно использовать сыворотку, консервированную хлороформом. Среду проверяют на стерильность в течение двух суток при 37° С.