Растительные среды. Применение растительных сред для выращивания фитопатогенных бактерий имеет очень большое значение, так как эти среды по своему составу приближаются к естественным условиям их существования. Проведенные наблюдения показывают, что фитопатогенные бактерии на растительных средах значительно меньше вырождаются, сохраняя в течение длительного срока нормальными биологические свойства. Поэтому в микробиологической практике при выращивании возбудителей бактериозов растений пользуются различными средами, приготовленными в виде настоек, вытяжек, гидролизатов, кусочков тканей, а также плотных сред из плодов, ягод, овощей и фруктов. В бактериологической практике наиболее широко используются среды из картофеля. Кроме того, для этой же цели применяется морковь, свекла, огурцы, капуста, бобы гороха, соя, семена овса, пшеницы, льна и др.

Снова сварить, отфильтровать, разлить в соответствующую посуду и стерилизовать при 1,5 атм 20 мин.
2. Картофель с глицерином. Ломтики или цилиндрики картофеля выдерживают некоторое время до стерилизации в 5–10%-ном растворе глицерина.
3. Картофельно-декстрозный агар

Картофель, нарезанный небольшими ломтиками, заливают 1 л воды, кипятят или нагревают текучим паром 40 мин. Затем фильтруют, доливая до 1 л водой, растворяют глюкозу и при нагревании разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм 10 мин.
4. Желатина с картофельным соком по Аппелю. Очищенный от кожуры картофель помещают в крепкий раствор соды. Через 24 час его вынимают, промывают водой, пропускают через мясорубку и отжимают сок через полотно. Остаток снова промывают таким количеством воды, чтобы в общей сложности после отжимания сока его было 1 л. Сок ставят в холодное место (летом добавляя немного хлороформа). На следующий день, удалив осевший крахмал, нагревают в автоклаве до 120°С 15 мин, затем охлаждают, подкисляют 2%-ным раствором лимонной кислоты, кипятят по полчаса еще два дня и после охлаждения нейтрализуют концентрированным раствором соды и добавляют к этому отвару агар или желатину.
5. Картофельная среда по Буркгольдеру. К 1 л картофельного отвара, приготовленного из 300 г очищенного картофеля, прибавляют 5 г пептона. 2 г Na2НРO4 и 2 г NaCI, 1 г лимоннокислого натрия, 6 г аспарагина, 6 г глюкозы, 1,5–2% агар-агара и стерилизуют 30 мин при 1 атм.
6. Картофельные цилиндрики.
A. Для приготовления цилиндриков заранее стерилизуют в автоклаве пробирки Ру с небольшим количеством воды. Затем у картофельного клубня срезают оба конца, чтобы полученные плоскости срезов были параллельны между собой. Стерильным цилиндрическим пробойником вырезают цилиндры, рассекают их косым срезом на два клина, которые опускают затем в пробирки. Пробирки с картофельными цилиндрами стерилизуют при 115° С. При отсутствии пробирок Ру на дно обычных пробирок можно помещать обожженную пробку или накалывать картофельные цилиндры на спички или кусочек стеклянной трубочки.
Б. Отборные клубни неразваривающегося картофеля очищают при помощи щетки от грязи, моют водой, кладут на 1 час в раствор сулемы (5 : 1000), промывают водопроводной водой под краном 30 мин, очищают прокаленным и промытым в спирте ножом от кожуры, опускают на 2–3 час в 1%-ный раствор соды, чтобы нейтрализовать кислую реакцию. В дальнейшем поступают так, как написано в рецепте «А».
B. Крупные клубни картофеля обмывают водой и очищают от кожуры. Пробойником с диаметром, соответствующим ширине пробирок, вырезают из клубня столбики, которые разрезают наискось пополам. На дно пробирки для улавливания воды, выделяемой картофелем при стерилизации, рекомендуется положить небольшой кусочек ваты. Пробирки с картофелем стерилизуют при 1 атм 20 мин.
7. Картофельные ломтики. С клубня снимают стерильным ножом кожуру и разрезают поперек на три–пять частей, толщиной от 0,8 до 1,4 см. раскладывая полученные ломтики по одному в чашки Петри или Коха на увлажненную фильтровальную бумагу. Некоторые авторы рекомендуют проводить стерилизацию поверхности клубня раствором сулемы 1 : 5000, хотя в этом нет настоятельной необходимости.
По описанным выше методам можно готовить цилиндрики и ломтики из моркови.
8. Полужидкая картофельная среда. Эта среда готовится обычным способом с той лишь разницей, что процент агара уменьшается до 0,25.

Варить 10 мин, отцедить, развести водой в два раза. На 1 л полученного отвара добавить:

Соевый агар по Шафрану. 100 г сои заливают 600 мл водопроводной воды и оставляют на восемь суток при комнатной температуре. В результате гниения происходит расщепление белка с образованием таких аминокислот, как тирозин, цистин и триптофан.
Через восемь суток снимают с поверхности настоя плесень и затем кипятят 40 мин. После этого среду фильтруют через ватный фильтр, разбавляют водой в два раза (получается 400 мл среды), прибавляют 8 г агара и 800 мл двузамещенного фосфорнокислого натрия (0,2%), ставят на огонь и кипятят 10 мин. Определяют при помощи бромтимол-бляу pH, прибавляют 10% щелочи до нейтральной реакции. Бульон и агар готовят без прибавления пептона.
Питательные среды из сои, фасоли, овса и пшеницы по Раховскому.
200 г семян, хорошо промытых водой, слегка дробят и заливают 1–2 л дистиллированной воды, кипятят в течение 1 час, полученный отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 120° С 20 мин. После этого не менее чем через сутки верхний слой отвара сливают и фильтруют через бумажный фильтр. Из отвара готовят среды с пептоном и без него. Цвет сред несколько темнее мясных. Через короткое время хранения при комнатной температуре в отваре появляется осадок, устраняемый двух-трехкратной фильтрацией через бумажный фильтр.
Среды из гороха. Особенно много белка содержится в бобовых растениях, в частности в горохе.
1. Среда из непроросшего гороха. Размолотый в крупу горох заливают пятикратным количеством 1%-ного раствора хлористого натрия или 0,3%-ного раствора соляной кислоты и оставляют (время от времени помешивая) на 10 час; вытяжку сливают, остатки гороха отжимают через марлю и отстаивают в течение 15 час.
Жидкость сливают с крахмала и нагревают 30 мин при 120° С. Если экстракция производилась 1%-ным раствором хлористого натрия, перед автоклавированием к ней добавляют 0,1% соляной кислоты (2,3 мл концентрированной соляной кислоты с удельным весом 1,19 на 1 л среды). После автоклавирования фильтруют, устанавливают нужную реакцию, вновь фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве.
2. Среда из проросшего гороха. Горох заливают двойным по объему количеством водопроводной воды и оставляют для набухания на сутки. Через сутки воду сливают, горох рассыпают в кюветах, ежедневно слегка увлажняют. После шести-десятидневного проращивания горох перемалывают на мясорубке и заливают пяти-десятикратным (по отношению к сухому гороху) количеством 1%-ного раствора хлористого натрия или 0,3%-ного раствора соляной кислоты. После трех-четырехчасового настаивания при помешивании вытяжку сливают через марлю, а горох отжимают. Отстаивают от крахмала, нагревают 30 мин при 120° С, фильтруют, устанавливают pH, вновь фильтруют, стерилизуют под давлением.
Среда из сои по Беленькому, Поповой и Хаит. Предварительно промытые водопроводной водой 200 г семян сои заливают 1200 мл воды и оставляют на 18 час при комнатной температуре, воду вместе с семенами кипятят в аппарате Коха 40 мин, фильтруют через марлю и доливают до 1 л водой. К 1 л соевой воды добавляют при нагревании 5 г хлористого натрия, устанавливают нужную реакцию, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают, стерилизуют при 120° С в течение 30 мин. Агар готовят обычным способом. Среды можно применять без добавления пептона, но лучшие результаты получаются, если к среде добавить пептон.
Растительные экстракты как факторы роста при выращивании фитопатогенных бактерий. Для выращивания некоторых видов фитопатогенных бактерий необходимо добавление к средам веществ типа витаминов, которыми так богаты растительные экстракты. Приводим рецепты изготовления некоторых из них.
1. Свекольный экстракт по Северину. Свеклу, очищенную и нарезанную на куски, пропускают через мясорубку. К 1 кг такого фарша добавляют 2 л предварительно нагретой до 40° С воды, температуру доводят до 62–65° С и экстрагируют при этой температуре, все время помешивая. Затем взвесь отжимают через ватно-марлевый фильтр, фильтрат подкисляют 3–5%-ной уксусной кислотой и кипятят в течение 10 мин для свертывания белков. Полученный экстракт добавляют к средам в количестве 15–20%. После добавления среды разливают и стерилизуют как обычно.
2. Овсяный экстракт по Северину. Овес, предварительно промытый, замачивают на одни сутки в воде, затем воду сливают, а разбухший овес пропускают через мясорубку. К 1 кг густой овсяной массы добавляют 2 л воды и экстрагируют при температуре 62–65° С. Овсяный экстракт молочного вида добавляют к средам в количестве 15–20%.
Дрожжевые среды. Дрожжи по своему химическому составу представляют ценный питательный субстрат благодаря высокому содержанию питательных веществ и витаминов. В связи с этим они могут быть с успехом применены как сырье для приготовления питательных сред. В практике использования этих сред для выращивания фитопатогенных бактерий применяются обычно различные экстракты и автолизаты, добавляемые в том или другом проценте к питательным средам, главным образом растительным. Поэтому мы и приводим рецептуру получения некоторых экстрактов и автолизатов, а также некоторых сред.
Дрожжевая вода как заменитель мясной воды. 50–100 г сухих прессованных дрожжей размешивают в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через влажный фильтр и стерилизуют текучим паром. Полученная жидкость вполне заменяет мясную воду или мясной экстракт.
Дрожжевой автолизат как заменитель мясной воды. 200 г отстоявшихся пивных дрожжей разводят в 1 л воды, добавляют 2 г одноосновного фосфорнокислого натрия, нормальный раствор едкого натрия до pH 6,1 и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37° С в течение двух суток, после чего устанавливают pH 7,4, кипятят 30 мин и фильтруют через бумагу, разливают и стерилизуют; применяют вместо мясной воды.
Дрожжевой экстракт по Рубинскому. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды и смесь кипятят 1 час, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр. Полученную прозрачную желтую жидкость стерилизуют и сохраняют до употребления. Добавляют к питательным средам от 5 до 10%.
Дрожжевой лизат. Прессованные хлебные дрожжи размельчают в посуде, предназначенной для гидролиза, послойно пересыпают поваренной солью, из расчета 3% к весу дрожжей. Дрожжи с солью оставляют при комнатной температуре на 20–30 мин, до заметного разжижения, а затем подогревают до 60–65° С при постоянном помешивании до полного разжижения. После этого на 1 кг дрожжей прибавляют около 60–80 мл разведенной 1 : 10 соляной кислоты (удельный вес 1,19) до pH 4,5–5,0 (по метилроту) и выдерживают при температуре 40–80° С в течение 48 час. Полученный лизат сгущают выпариванием в котле до густоты сметаны.
Готовый дрожжевой лизат хранят в стерильных широкогорлых банках без добавления консерванта. Дрожжевой лизат в количестве 50 г на 1 л воды добавляют перед стерилизацией в обычный агар и бульон, в среды Эндо и Эйкмана.
Молочные среды. Молоко является прекрасной питательной средой для большинства микроорганизмов. В состав молока входит 88% воды, 4,5% молочного сахара, 3,5% жира, 3,5% казеина и около 1% минеральных соединений.
Для приготовления питательных сред употребляется обезжиренное снятое молоко, так называемый обрат (находящийся в молоке жир неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов). Обрат получают сепарированием цельного молока, нагретого до 34° С. Молоко также можно отстаивать и снимать с него жир. Стерилизация молока связана с некоторыми трудностями в силу того, что в нем часто содержатся весьма устойчивые споры. Содержание молочного сахара в молоке определяет режим стерилизации. Лучше всего молоко подвергать дробной стерилизации три дня подряд при 100° С по 1 час. При стерилизации в автоклаве обычно наблюдается побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизации казеина. Перегретое, побуревшее молоко нельзя использовать в качестве среды. Если стерилизация затягивается, то иногда при стоянии на дно выпадает и частично пептонизируется казеин; молоко свертывается при pH 4,6.
Молоко. Свежее обезжиренное (сепарированное или снятое) молоко разливают в стерильные пробирки и стерилизуют в течение 10 мин при температуре 112° С и давлении 0,5 атм по манометру. После стерилизации молоко выдерживают трое суток в термостате при 30° С, чтобы проросли споровые или другие устойчивые к нагреванию формы. Через три дня каждую пробирку с молоком просматривают и удаляют проросшие.
Лакмусовое молоко. К обезжиренному молоку прибавляют лакмусовую настойку (около 5 мл на 100 мл молока). Цвет молока должен быть слабо-синий. Затем молоко разливают в стерильные пробирки и стерилизуют так же. как простое молоко с последующей трехдневной выдержкой в термостате.
Молочная сыворотка по Петрушки. Равные части молока и воды нагревают до 45°С, затем добавляют небольшими порциями 1%-ный раствор соляной кислоты до полного осаждения казеина. Осадок казеина отфильтровывают через полотно, фильтрат нейтрализуют насыщенным раствором соды до нейтральной реакции по лакмусу, кипятят в течение 1– 2 час в аппарате Коха. Если фильтрат после стерилизации мутный, его вновь фильтруют, кипятят и при необходимости реакцию исправляют до нейтральной. Добавляют стерильно 5% лакмусовой настойки до сине-голубого цвета (красного в проходящем свете), разливают в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром три дня по 30 мин.
Молочный агар по Эйкману. Стерилизуют отдельно молоко и мясопептонный агар, смешивают стерильно одну часть молока и три агара. При совместной стерилизации молока с агаром выпадают хлопья казеина.
Бромтимол-бляу – молоко по Жданову. Обезжиренное молоко стерилизуют дважды текучим паром. На 100 мл молока стерильно добавляют 1 мл 0,4% спиртового раствора бромтимол-бляу и подщелачивают раствором едкого натра до сине-зеленого цвета. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют еще раз при 112° С в течение 40 мин. Среда имеет травянисто-зеленый цвет без желтого или синего оттенка.

---

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Добавить