Методы исследования живых клеток

31.01.2014

Морфология клеток фитопатогенных бактерий может варьировать в довольно широких пределах даже в одной и той же колонии. При изучении формы и величины клеток, принадлежащих к одной и той же популяции, оказывается, что они неодинаковы. Морфологические особенности фитопатогенных бактерий можно изучать на живых и убитых объектах. Лучше всего эти исследования проводить на живых неокрашенных препаратах, так как при изготовлении мазков, их высушивании и окрашивании наблюдается плазмолиз содержимого клетки, что изменяет ее нормальные морфологические признаки. Клетки следует рассматривать в дистиллированной воде, в которой они увеличиваются, а не в гипертонических растворах, где они сжимаются. Следует отметить, что форму и величину клеток надо изучать в культурах, выросших на различных, в том числе стандартных, средах. Установлено, что условия жизни бактерий, зависящие от состава сред, аэрации, осмотического давления, реакции среды и ее поверхностного натяжения, температуры выращивания, оказывают на них большое влияние.
При изучении бактерий в живом состоянии пользуются различно приготовленными препаратами – методами раздавленной и висячей капли, рассматривая их в неокрашенном и окрашенном состоянии.
Раздавленная капля. На чистое предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды. Затем платиновой петлей вносят небольшое количество исследуемых односуточных или более молодых бактерий и тщательно, но осторожно смешивают их с водой. Полученную каплю бактериальной взвеси накрывают покровным стеклом. Вместо стерильной водопроводной воды можно использовать жидкие питательные среды, например МПБ.
Приготовленный препарат рассматривают под микроскопом, используя сухую систему с большим увеличением и иммерсию. При наблюдении следует различать активную подвижность бактерий, которая характеризуется поступательным движением клеток в различном направлении, отличаясь от пассивного движения с током жидкости, когда вся масса клеток движется в одном направлении.
Висячая капля. Для длительных наблюдений подвижности, развития и размножения бактерий пользуются висячей каплей. Негустую взвесь бактерий, приготовленную в жидкой питательной среде или физиологическом растворе, наносят на стерильное стекло, затем перевернутое покровное стекло с висячей каплей накладывают на стерильное предметное стекло с углублением посередине. Капля должна свободно висеть и не касаться краев и дна предметного стекла. Для герметичности края покровного стекла смазывают вазелином. При работе с висячей каплей надо стремиться устанавливать освещение по всем указанным правилам, хотя кривизна лунки не позволяет получить четкое изображение диафрагмы поля. Этому мешают также и капельки воды, конденсирующиеся на дне камеры.
Негативный способ исследования живых бактерий. Классическим способом негативного исследования живых бактерий является метод Бурри. Заключается он в том, что 0,1 мл жидкой специально приготовленной стерильной туши, запаянной в капилляре, выпускают около одного из коротких краев предметного стекла и, прибавляя в тушь капельку исследуемого материала, тщательно перемешивают его с тушью. Затем при помощи шлифованного предметного стекла готовят тонкий мазок по типу мазков крови. После высыхания мазка, не фиксируя, проводят исследование. На дымчатом фоне хорошо видны четко очерченные тела бактерий. Тушь готовится следующим образом: лучшая натуральная жидкая тушь разводится дистиллированной водой в десять раз (можно натереть сухую китайскую тушь такой же густоты), длительно центрифугируется, после чего верхний слой отсасывается, проверяется под микроскопом с иммерсией на отсутствие грубых гранул. И если тушь пригодна для работы, то ее разливают по 0,1 мл в капилляры; запаивают и стерилизуют в автоклаве.
Для приготовления аналогичных негативных препаратов вместо туши можно пользоваться 10%-ным водным раствором опаловой голубой или 3%-ным раствором конго-красной, 10%-ным раствором нигрозина или 2%-ным раствором колларгола.
Прижизненная окраска. Для лучшей видимости бактерий в раздавленной капле добавляют в жидкости растворов некоторые красители (метиленовая синь, нейтральный красный, янусовый зеленый, везувин, бриллиантовый крезоловый, синий) в больших разведениях: от 0,001 до 0,0001%. Окрашенные этими веществами бактерии длительное время остаются живыми и не теряют способности размножаться.
Метод дифференцированной окраски живых и мертвых клеток. Современная микробиологическая техника располагает различными методами дифференциации живых и мертвых клеток. К числу их относятся разнообразные культуральные, культурально-морфологические, физико-химические, цитохимические, люминесцентные и другие методы. Следует, однако, указать, что они недостаточно эффективны. Наиболее универсальными являются культуральные методы, основанные на принципе выявления живых клеток по количеству выросших колоний, но и они имеют ряд серьезных недостатков, ограничивающих ценность получаемой при их помощи количественной информации. Основной недостаток заключается в наличии большого числа промежуточных форм, отнесение которых к живым или мертвым клеткам не всегда возможно. Приводим некоторые из способов.
Наличие мертвых и живых клеток можно легко определить при помещении их в концентрированный раствор хлористого натрия. У живых клеток будет наблюдаться явление плазмолиза, т. е. уменьшение объема клетки, мертвые клетки не изменяют своего размера. При помощи окраски 1%-ным эозином (эозин желтоватый или эозин натрий или калий) можно получить ориентировочную оценку живых и мертвых клеток испытуемой популяции. Мертвые клетки сразу же окрашиваются эозином, в то время как живые не окрашиваются и похожи на светлые, хорошо очерченные пятнышки, часто окрашенные в цвет, дополнительный к оттенку фона (если фон красный, то тела живых бактерий кажутся слегка зеленоватыми).
В.Г. Дроботько (1934), видоизменив метод Энрица (1928), для окраски капсул бактерий в живом виде предложил такую методику.
На предметное стекло наносится капля 3%-ного водного раствора конго-рот, в которую вносится материал, подлежащий исследованию. Препарат подсушивают на воздухе, а затем покрывают насыщенным спиртовым раствором кислого фуксина с 0,5% крепкой серной кислоты. Этот раствор одновременно фиксирует клетки. Необходимо следить, чтобы краска (вторая) не высыхала. Через 2–3 мин препарат, не промывая, просушивают при помощи фильтровальной бумаги и рассматривают под микроскопом. Фон препарата сине-фиолетовый, как и «мертвых» клеток, в результате изменения цвета конго-рот под влиянием серной кислоты. Живые клетки окрашиваются фуксином в яркокрасный цвет. Следует отметить, что иногда не вся «мертвая» клетка становится темной – в ней имеются и красные участки. Кроме того, степень окраски также неодинакова: некоторые клетки черно-синие, другие – серовато-синие с целой гаммой переходных тонов этих цветов. При необходимости можно подсчитать количество поврежденных клеток.