Окраска по Граму

31.01.2014

Окраска бактерий по Граму имеет важное диагностическое значение. Бактерии, прочно удерживающие окраску по Граму, получили название грамположительных. Бактерии, не окрашивающиеся по Граму, называются грамотрицательными.
Для окраски бактерий по Граму необходимы следующие реактивы.

Смесь в бутылке ставится в термостат на 24 час (можно и больше). Затем краску фильтруют.

В 5 мл дистиллированной воды растворяют йодистый калий, потом добавляют йод (2 г) и доводят объем дистиллированной водой до 300 мл. Раствор Люголя необходимо защищать от света, поэтому его надо хранить в склянках бурого стекла и в прохладном месте. Под влиянием света и тепла образуется йодная кислота и раствор становится негодным для употребления. Проконтролировать раствор Люголя можно при помощи лакмусовой бумажки. Если обнаруживается кислая реакция, то такой раствор надо нейтрализовать двууглекислой содой.
Окраска по Граму производится следующим образом:
- на фиксированный огнем мазок наносят генциан или кристалл-виолет на 0,5–1 мин;
- сливают краску и, не промывая водой, на препарат наливают раствор Люголя на 1 мин до полного почернения мазка;
- сливают люголевский раствор и наливают 95°-ный спирт на 0,5–1 мин, причем препарат надо покачивать и сменять спирт до тех пор, пока он не станет бесцветным; промывают водой;
- дополнительно окрашивают фуксином Пфейфера, сафранином или везувином в течение 2–3 мин.
- сливают краску, промывают водой и высушивают мазок, ставя стекло набок.
Способ окраски по Граму требует точного соблюдения времени при обработке препарата различными жидкостями. Особенно это относится к спирту. При более продолжительном, чем нужно, сроке все бактерии обесцветятся, при недостаточном – препарат окажется перекрашенным. Надо также помнить, что время действия краски, протравы и спирта зависит от толщины мазка: толстый мазок надо дольше красить и дольше обесцвечивать. Неравномерный мазок будет и неравномерно краситься, что может дать повод к неправильному заключению. Все это свидетельствует о необходимости хорошо и уверенно владеть техникой приготовления мазков и их окрашивания. Во избежание ошибок, которые иногда происходят при окраске по Граму, в литературе предлагается внести некоторые видоизменения в методику. В числе их можна назвать методику, предложенную Саватеевым для медицинской практики. Сущность ее заключается в том, что после окраски препарата генциан-виолетом и обработки раствором Люголя применяется отмывка не чистым спиртом, а спиртом с добавлением йода, под действием которого бактерии приобретают постоянный необесцвечивающийся темно-лиловый цвет (спирт по Саватееву – 50 мл спирта + 5 мл 5%-ной йодной настойки).
В литературе описано несколько модификаций методов окраски по Граму, из которых мы приведем лишь некоторые.
1. Окраска мазков по Граму, видоизменнная А. Синевым (1930):
а) на зафиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную 1%-ным спиртовым раствором кристалл-виолета;
б) наносят на бумажку две-три капли воды и оставляют на 2 мин;
в) снимают бумажку и наливают раствор Люголя;
г) обесцвечивают спиртом или ацетоном;
д) докрашивают фуксином Пфейфера.
Мазки получаются четкие и без осадка.
Для приготовления бумажек нарезают длинные полосы фильтровальной бумаги шириной 3 см, окрашивают и развешивают на веревке для просушки. Когда бумага хорошо подсохнет, ее нарезают кусочками по величине предметных стекол, складывают в банки и сохраняют впрок.
2. Модификация метода Грама по Хакеру (1921). Необходимые следующие реактивы:
а) кристаллический фиолетовый Хакера (с щевелевокислым аммонием).
Раствор А – кристаллического фиолетового (90% содержания краски) 2 г, этилового спирта (95%-ного) 20 мл.
Раствор Б – аммония щавелевокислого 0,8 г, дистиллированной воды 80 мл.
Растворы А и Б смешивают;
б) раствор Люголя в модификации Грама (йода кристаллического 1 г, йодистого калия 2 г, воды дистиллированной 300 мл).
в) раствор сафранина для докрашивания: сафранина (2,5% в 95%-ном этиловом спирте) 10 мл, дистиллированной воды 100 мл.
Препараты окрашивают в течение 1 мин кристаллическим фиолетовым (со щавелевокислым аммонием), промывают водопроводной водой не более 2 сек, наливают раствор Люголя и оставляют на 1 мин, затем промывают водой и высушивают. Докрашивают в течение 10 сек раствором сафранина, затем промывают водопроводной водой, высушивают, и исследуют.
3. А. В. Коронный (1959) рекомендует ускоренный метод окраски по Граму – окрашивание генциан-виолетом, обработка 5%-ным раствором фенола и обработка раствором Люголя и докрашивание карболовым фуксином Циля сокращается до 5 сек на каждый процесс. Обесцвечивание спиртом – 15 сек.
4. Окраска по Граму в модификации Г.П. Калины (1961). На предметное стекло наносят небольшую каплю дистиллированной воды и вносят в нее минимальное количество бактериальных клеток. Суспензию смешивают с петлей полупроцентного спиртового раствора кристаллического фиолетового, распределяют равномерно по площади 1 см2, подсушивают и фиксируют однократным проведением через пламя. После этого препарат в течение 1 мин обрабатывают следующим реактивом; 5%-ного раствора фуксина 10 мл, 10%-ного раствора йода 10 мл, ацетона 10 мл и 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия 70 мл. Опускают препарат на одно мгновение в этиловый спирт и быстро высушивают фильтровальной бумагой.
5. Окраска по Граму в модификации К.М. Бартона (1962). Применение ацетона дает более чистые препараты. Дополнительная окраска фуксином менее эффективна. Наиболее контрастным дополнительным красителем является смесь Сандифорда – 0,05 г малахитового зеленого, 0,15 г пиронина и 100 мл дистиллированной воды.