Новости

Окраска жгутиков

31.01.2014

Жгутики, являющиеся органами движения бактерий, представляют собой нитевидные образования, длина которых во много раз превышает длину тела бактерий. Количество и размещение жгутиков может быть различным (рис. 43). Если бактерии имеют на одном конце по одному жгутику, они называются мокотрихами, если по несколько – лофотрихами, при наличии пучков жгутиков на обоих концах клетки – анфитрихами. У некоторых бактерий жгутики размещены вокруг всего их тела, такие бактерии называются перитрихами. Толщина жгутиков у различных бактерий сильно варьирует. Наиболее толстыми жгутиками обладают монотрихи, у некоторых лофотрихов они могут скручиваться в косы.

Окраска жгутиков

Жгутики имеют слабое сродство к красителям и для их окраски требуется применение протравы, благодаря которой увеличиваются плотность и толщина жгутиков. Главное затруднение при их исследовании заключается в том, что они легко отпадают от клеток во время приготовления мазка. Поэтому необходима особая осторожность при нанесении бактериальных взвесей на предметное стекло. Для изучения жгутиков бактерий стекла готовятся следующим образом. Их кипятят в растворе двухромовокалиевой соли в крепкой серной кислоте. Затем, слив жидкость, промывают в слабом растворе едкого натра. Эту операцию повторяют дважды. После этого стекла промывают водой и помещают в банку с 96%-ным спиртом, где и хранят, используя по мере надобности.
Окраска жгутиков является одной из самых тонких микроскопических операций. Для этой цели предложено много методов, из которых мы приведем лишь самые надежные.
Способ Леффлера. 1. Препарат готовят из молодой (12–24часовой) агаровой культуры бактерий, которую берут вблизи конденсационной воды и осторожно, не разбалтывая, переносят в 1–2 мл стерильной воды, оставляя там петлю или пипетку с культурой до тех пор, пока бактериальная масса не разойдется в жидкости. Через 30–60 мин из пробирок взвесь бактерий наносят на предметное стекло и дают возможность высохнуть при комнатной температуре. Можно фиксировать мазок, проводя один раз обратной стороной через пламя горелки.
2. Препарат обрабатывают в течение 15–20 мин при комнатной температуре протравой следующего состава: 1 мл насыщенного раствора фуксина + смесь из 10 мл 25%-ного водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа. Протраву готовят за несколько дней до применения, перед употреблением фильтруют. Для приготовления протравы могут быть использованы не все сорта танина. Нужный сорт надо подобрать. Для сокращения времени действия протравы можно слегка нагревать препарат в течение 3– 5 мин.
3. Препарат промывают сильной струей дистиллированной воды в течение 30 мин. Затем тонкой тряпочкой удаляют с краев покровного стекла розовую каемку подсохшей протравы и вторично промывают дистиллированной водой, высушивают при комнатной температуре на воздухе.
4. Окрашивают при легком нагревании (до появления паров) в течение 3–4 мин либо карболовым фуксином Циля, либо раствором, содержащим одну часть насыщенного спиртового раствора основного фуксина и десять частей воды.
5. Промывают водой и высушивают.
Метод Мелони. 1. На покровные стекла наносят взвесь бактерий. Мазки высушивают в течение 24 час, затем фиксируют 3–8 мин в смеси равных объемов 1%-ных растворов хромового ангидрида (СrO3) и хлористого кобальта (СоСl2).
2. Препарат промывают дистиллированной водой.
3. Обрабатывают жидкостью Пульхера в течение 3 мин. Указанную жидкость готовят следующим образом. Отдельно готовят три раствора: 0,45 г кристалл-виолета в 100 мл воды; 0,9 г танина в 100 мл воды (оба раствора готовят при нагревании до полного растворения указанных веществ) и 100 мл 3%-ной соляной кислоты. После охлаждения первых двух все три раствора последовательно смешивают друг с другом. Хранят в темной склянке с притертой пробкой.
4. Промывают в дистиллированной воде.
5. Обрабатывают в течение 25–40 сек в растворе аммиачного серебра, налитого в часовое стекло.
Аммиачное серебро готовят перед употреблением. К приготовленным впрок 10 мл 2%-ного азотнокислого серебра прибавляют по каплям раствор 2%-ного нашатырного спирта до появления осадка, а потом до частичного растворения его в небольшом избытке аммиака так, чтобы осталась легкая стойкая муть.
6. Препарат промывают водопроводной водой, высушивают и рассматривают в иммерсионной системе.
Метод позволяет выявить даже тончайшие детали в строении жгутиков.
Метод Грея. 1. На препарат молодой (18-часовой) культуры наливают свежеприготовленную протраву и оставляют на 8– 10 мин. Протрава – 5 мл насыщенного водного раствора КАl (SO4)2 • 12Н2O, 2 мл 20%-ного водного раствора танина, 2 мл насыщенного водного раствора HgCb; для хранения добавляют несколько капель хлороформа.
2. Препарат промывают дистиллированной водой.
3. Наливают свежеотфильтрованный фуксин Циля и оставляют на 5 мин для нагревания.
4. Промывают в водопроводной воде.
5. Высушивают на воздухе и исследуют.
Результаты метода – жгутики окрашиваются в красный цвет.
Метод Грея, модифицированный Петрук. 1. Бактериальную культуру помещают в 1%-ный раствор формалина и выдерживают в течение 2 час при температуре 37° С. Затем из взвеси бактерий готовят препарат и высушивают его при температуре 37° С.
2. Обрабатывают протравой, предложенной Греем.
3. Промывают дистиллированной водой.
4. Наносят вместо карболового фуксина раствор азотнокислого серебра и слегка подогревают на пламени горелки до образования коричневого фона. Раствор азотнокислоро серебра готовят следующим образом: 1 г азотнокислого серебра растворяют в 20 мл дистиллированной воды, затем по каплям добавляют 25%-ный раствор аммиака до тех пор, пока образующийся темно-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворится и останется легкая опалесценция. Для окрашивания исходный раствор разбавляют дистиллированной водой в десять раз.
5. Прополаскивают водой.
6. Высушивают на воздухе и исследуют.
Результаты окраски – жгутики имеют желто-коричневый цвет.
Метод Цетнова. 1. Петлю суточной культуры помещают в каплю воды. Затем одну петлю полученной взвеси бактерий осторожно переносят в другую каплю, в которую прибавлены одна-две капли 2%-ной осмиевой кислоты. Из этой капли берут небольшую петлю жидкости для приготовления тонкого мазка.
2. Высушенный мазок протравливают следующим образом. На часовое стекло наливают нагретой протравы и на него помещают препарат мазком вниз на 2–10 мин, после чего охлаждают часовое стекло, а препарат осторожно промывают.
Приготовление протравы: 10 г танина растворяют в 150 мл воды при температуре 40–50° С, добавляют 27–28 мл 5%-ного раствора рвотного камня (КН4С4O6(SbO) и нагревают его до растворения образовавшегося осадка. Если протрава остается прозрачной, то к ней добавляют 1 мл указанного раствора до появления легкой мути опалесценции. В случае образования сильной мути к протраве добавляют немного танина. Для длительного сохранения протравы к ней добавляют кристаллик тимола.
3. Протравленный препарат обрабатывают раствором серебра до появления пара и почернения мазка, затем промывают водой и рассматривают под микроскопом.
Раствор готовят следующим образом: 2–3 г сернокислого серебра взбалтывают в 200 мл воды для получения насыщенного раствора, затем смешивают равные объемы раствора сернокислого серебра и воды и прибавляют 33%-ный раствор этиленамина до растворения первоначально образовавшегося осадка. Раствор следует хранить в темноте. В этих условиях он годен к употреблению в течение года.
Новый метод окраски жгутиков. Из активно подвижной, молодой (12–15-часовой) культуры готовят негустую суспензию бактерий в стерильной воде (одну петлю культуры вносят в 4–5 мл воды) и выдерживают 2–3 нас в холодильнике при 7–10° С.
На тщательно очищенные по методу Цетнова предметные стекла (лучше не бывшие в употреблении) осторожно наносят петлей несколько капель жидкости, взятой из верхнего слоя приготовленной суспензии. Мазки высушивают при 45–50° С, так как при медленном высушивании жгутики часто отрываются и не фиксируются.
Препарат обрабатывают протравой, в качестве которой рекомендуется смесь равных количеств 5–10%-ного водного раствора танина и насыщенного водного раствора сернокислого цинка, сернокислого железа или соли Мора. Лучшие результаты дает протрава, выдержанная в холодильнике пять–десять дней и профильтрованная через мембранный фильтр; после 10–15минутного воздействия протравой препарат тщательно (5– 10 мин) промывают под водопроводным краном. Затем на препарат наливают 5%-ный водный раствор аммиачного серебра и красят 5 мин при легком подогревании, не допуская появления паров, после чего препарат тщательно промывают водой, высушивают на воздухе и рассматривают под микроскопом.
При рекомендуемом методе тела бактерий окрашиваются в черный цвет, а жгутики – в синий или коричневый.
Метод Лайфсона (1960). Автор отмечает, что образование жгутиков и их активность не коррелирует с другими физиологическими свойствами бактерий. Среда, наиболее благоприятная для роста и метаболизма, не бывает в то же время таковой для жгутикования и подвижности. Вещество, оказывающее ничтожный эффект на рост и метаболизм, может тормозить жгутикование и активность жгутиков. К числу факторов, имеющих особое значение для образования жгутиков, относятся температура, фаза роста и развития микроба, химический состав среды, pH, наличие фосфатов. Жидкие среды предпочитаются агаровым. Для изучения жгутиков Лейфсон рекомендует выращивать бактерии при 20° С.
При указанной температуре бактерии находятся в более активном состоянии. Лучшее жгутикование наблюдается в логарифмической и максимально постоянной фазах роста. Следует отметить, что бывают случаи, когда характер жгутикования изменяется в процессе роста у некоторых бактерий. В молодых культурах у штаммов таких бактерий можно отметить многочисленные боковые жгутики, в то время как в старых имеются только полярные жгутики.
Для окраски жгутиков используют три основных раствора: основный фуксин в 95%-ном этиловом спирте – 1,2%, таниновая кислота в дистиллированной воде – 3%, хлористый натрий в дистиллированной воде – 1,5%. Основной фуксин следует применять или в виде чистого парарозанилин ацетата, или смеси парарозанилин гидрохлорида и парарозанилин ацетата, но не более 2/3 частей гидрохлорида. Основной фуксин должен иметь запах уксусной кислоты. Разрешается готовить раствор фуксина приблизительно за один день до применения. Таниновая кислота должна иметь слабый желтый цвет. Для предупреждения роста плесени к таниновой кислоте добавляют фенол в концентрации приблизительно 1 : 2000. Растворы таниновой кислоты и хлористого натрия могут быть смешаны в равных частях или приготовлены как один раствор с 1,5% таниновой кислоты и 0,75% хлористого натрия. Основные растворы должны сохраняться в холодильнике. Краску готовят, смешивая, друг с другом равные части трех основных растворов или добавляют две части солевого раствора таниновой кислоты к одной части раствора краски. Бутылку с краской плотно закупоривают. Краску можно применять сразу же после ее изготовления. Во время ее хранения в бутылке образуется осадок, который не следует нарушать при использовании краски. Краска подвергается постепенному изменению во время хранения, что вызывает необходимость увеличения времени окраски. Изменение качества краски более быстро наступает при высоких температурах. При комнатной температуре раствор краски годен в течение одной недели, в холодильнике – один-два месяца и неограниченно долго при глубоком замораживании. После оттаивания краску следует тщательно перемешать.
Окраску препаратов Лайфсон рекомендует проводить на предметных стеклах, расположенных на наклонной подставке. При помощи пастеровской пипетки 1 мл краски отбирают из верхней части раствора и наносят на ту часть предметного стекла, где расположен мазок. Краска не должна растекаться по предметному стеклу вне мазка или стекать с предметного стекла. На окраску жгутиков затрачивают от 5 до 15 мин. Препараты окрашиваются быстро при наличии свежеприготовленной теплой краски, высокой комнатной температуры, сильного движения воздуха, тонкого слоя краски и чистого пара-розанилин ацетата. Более длительное время необходимо при применении старых холодных растворов краски, низкой комнатной температуры, незначительной циркуляции воздуха, толстого слоя краски и высокой концентрации парарозанилин гидрохлорида в краске. При испарении спирта до концентрации 20–25% образуется коллоидальный осадок, который оседает на жгутиках, делая их толще и окрашивая в красный цвет.
Метод наблюдения жгутиков при помощи фазовой оптики по А. Мартину (1960). На предметное стекло наносят подряд несколько капель бульонной культуры или взвеси бактерий в
физиологическом растворе и закрывают их покровным стеклом так, чтобы слой жидкости содержал много воздушных пузырьков. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и исследуют препарат при помощи иммерсионного фазового объектива при сильном освещении (можно без фильтров). Находят край одного из воздушных пузырьков, а затем фокусируют микроскоп на тонкий слой жидкости, находящейся между воздушным пузырьком и покровным стеклом. Бактерии в этом слое кажутся в пять–десять раз более крупными, чем содержащиеся во взвеси; их жгутики бывают хорошо видны и легко могут быть сфотографированы.


Имя:*
E-Mail:
Комментарий: