Окраска ядерных элементов бактериальной клетки

31.01.2014

Как известно, разрешение вопроса об ядерном аппарате у бактерий представляет одну из труднейших задач в микробиологии. Среди многочисленных методов окраски для выявления ядерного вещества у бактерий особое значение приобрел метод Романовского–Гимза. Этот метод служит для одновременного выявления ядерных элементов и волютина. Окраска препаратов производится следующим образом.
1. Препарат фиксируют метиловым спиртом, спирт-формолом или жидкостью Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты промывают спиртом и тщательно высушивают на воздухе.
2. Обрабатывают краской Романовского–Гимза в течение 1–24 час. Для приготовления указанной краски пользуются слегка щелочной водой (pH 7,2). В современной прописи эта краска представляет смесь азура II (смесь равных весовых частей азура I и метиленового синего) и эозина. Продажный раствор содержит в своем составе метиловый спирт и глицерин. Для окрашивания берут одну каплю продажной краски на 1 мл воды.
3. Окрашенный препарат ополаскивают в воде pH 7,2 и исследуют.
Результаты – ядерные элементы окрашиваются в краснофиолетовый цвет, цитоплазма – в слабый розовый.
Метод Пешкова. С целью выявления протоплазмы бактерий в возрасте 18–24 час, плохо окрашиваемых по Романовскому– Гимза, предложено после обработки указанной краской докрашивать препараты бактерий подкисленным раствором светлого зеленого. В результате такой окраски протоплазма бактерий окрашивается в яркий зеленый или сине-зеленый цвет, ядерные элементы – в красно-фиолетовый.
Метод Пикарского. Для лучшего выявления ядерных элементов бактерий автор предложил непосредственно после фиксации обработку препарата 1-н. HCl при температуре 60° С в течение 7 мин. В результате гидролиза из протоплазмы удаляются рибонуклеотиды, маскирующие окраску хроматиновых элементов, ядерные элементы получают четкую темно-красную окраску, а протоплазма – розовую.
Реакция Фельгена. Препараты бактерий фиксируют жидкостью Карнуа, промывают 80°-ным спиртом и подвергают гидролизу в течение 7 мин 1-н. НСl, подогретой до 60° С. Затем препараты погружают на 1–2 мин в холодную 1-н. НСl и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шифера) па 3–4 час. (Способ приготовления реактива Шифера: 1 г растертого в ступке фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. Горячий раствор фильтруют, охлаждают до 50° С и добавляют 20 мл 1-н. НСl. К 1 г NaHSO4 приливают раствор фуксина, остывший до 20° С. Через сутки фуксин обесцвечивается, приобретает слегка желтоватый оттенок). Препараты последовательно промывают в трех кюветах с водой, содержащей SO2 (дистиллированной воды 200 мл, 10%-ного раствора NaHSO4 10 мл и 1-н. НСl 10 мл), по 20 мин в каждой кювете. После этого препараты промывают дистиллированной водой, высушивают и заделывают в канадский бальзам.
В результате осторожного гидролиза соляной кислотой освобождаются альдегидные группы тимонуклеиновой кислоты, специфические для ядерного вещества и дающие с фуксинсернистой кислотой фиолетовое окрашивание.
Метод Тюлана и Вандрели. Рекомендуется обработка препарата рибонуклеазой с целью удаления РНК из цитоплазмы. В результате этой предварительной обработки окрашивание по Романовскому–Гимза дает четкое выявление ядерных элементов различных бактерий.