Выделение чистых культур бактерий из одной клетки

31.01.2014

Выделение чистых культур фитопатогенных бактерий из одной клетки имеет очень важное значение при изучении образования колоний, процессов размножения, изменчивости и наследственности, влияния на возбудителей бактериозов растений различных дезинфицирующих веществ, антибиотиков и др. В литературе предложено уже много методов изолирования единичных клеток. Здесь мы приведем описание лишь некоторых из них.

Фракционный метод Пастера
Метод этот в настоящее время применяется очень редко и имеет большое историческое значение. Заключается он в следующем.
Небольшое количество исследуемого материала вносят в ряд пробирок со стерильным бульоном или другой жидкой питательной средой с таким расчетом, чтобы в последней пробирке примерно осталась одна клетка, при размножении которой будет получена чистая культура. Осуществляется это таким образом: каплю исследуемого материала, содержащую условно 1000000 бактериальных клеток, вносят в пробирку с 10 мл среды и тщательно перемешивают. Затем из этой пробирки 1 мл переносят в другую (также в 10 мл среды) и снова тщательно встряхивают. Эту процедуру последовательно повторяют еще пять-шесть раз. В последней пробирке получают одну бактериальную клетку, из которой потом развивается чистая культура.

Метод разведения с последующим высевом на твердую питательную среду
Из 1 мл взвеси бактерий, содержащей 30000000 микробных тел (по фотометрическому методу), при соблюдении правил стерильности производят десятикратные разведения до 10в-8.
Таким образом, в предпоследней пробирке (разведение 10в-7) должно находиться около трех микробных клеток. Затем по 1 мл каждого из трех последних разведений переносят и равномерно распределяют шпателем на подсушенных чашках Петри с картофельным агаром или другой твердой питательной средой. Чашки помещают в термостат на сутки, затем сохраняют при комнатной температуре. На третьи сутки в чашках вырастают единичные колонии. При использовании указанной методики можно предположить, что каждая колония выросла из одной клетки.
Кроме поверхностного рассева разведенного исходного материала применяют метод рассева в глубине плотной питательной среды по Р. Коху. Метод имеет существенные недостатки – колонии в толще среды медленно растут, морфологические признаки их не характерны, извлечение таких колоний затруднительно. Поэтому необходимо применять методы, создающие условия для выделения чистой культуры из заведомо одной бактериальной клетки. Делается это под контролем микроскопа с использованием приспособлений для микроманипуляций.

Метод микроколоний
По сравнению с методом рассевов бактериальной взвеси метод микроколоний имеет то преимущество, что при его применении производится прямое выделение культуры из одной клетки.
Суть метода заключается в том, что из микробных клеток, подлежащих разведению, готовится сильно разбавленная взвесь в 0,5%-ном агаре или желатине, которая тонким слоем наносится на поверхность стерильного стекла. Стекло закрепляют над влажной камерой в виде предметного стекла с вышлифованными углублениями или стеклянного кольца.
Препарат с отмеченными под контролем микроскопа отдельными клетками помещают в термостат до образования колоний. Затем при помощи петли или пипетки колонии переносят в отдельные пробирки.
Метод микроколоний дает возможность использовать большие увеличения микроскопа и сравнительно надежно защищать микроколонии от высыхания и загрязнения извне.
Технически метод доступен и надежен, так как производится перенос в питательные среды выросших из отдельных клеток колоний и исключается грубый и ненадежный перенос от руки отдельных мелких клеток.

Метод агаровых блоков Эрскова
Микробную взвесь наносят на слой aгapa толщиной 2– 3 мм, помещенного на стерильное стекло, затем отдельные квадратики агара переносят на стерильные перекрестно расчерченные покровные стекла, которые с поверхности закрывают стерильным покровным стеклом. Под микроскопом, применяя сухую или иммерсионную систему и матовое освещение, отмечают те квадратики агара, которые содержат одну клетку. Стекла помещают в термостат. Кусочки агара вместе с выросшими в них колониями при помощи платиновой иглы переносят в питательную среду.
Основной недостаток метода – возможность загрязнения из окружающего воздуха.

Метод Хорта с применением перфорированных пластинок
На стерильную поверхность предметного стекла наливают тонкий слой агара, на который после застывания наносят сильно разведенную бактериальную взвесь. На агар накладывают тонкую целлулоидную перфорированую пластинку и сверху накрывают стерильным покровным стеклом. Под микроскопом отмечают ячейки, содержащие по одной клетке. Колонии, выросшие в таких ячейках, переносят «гарпуном» в питательную среду.

Метод «ртутного щита» Топли, Бернарда и Уилсона
Этот метод заключается в следующем: незначительное количество шестичасовой культуры исследуемых бактерий вносят в 10%-ную желатину на пептонной воде и выдерживают при 37° С в течение 2 час. Маленькую каплю желатины петлей наносят на стерильное предметное стекло и накрывают стерильным покровным стеклом из кварца или селинита. Жидкость должна распределяться тонким слоем и совершенно не содержать пузырьков воздуха. Под микроскопом находят единичную клетку. На кварцевое стекло над клеткой при помощи тонкой железной проволочки наносят капельку ртути. Затем препарат облучают ультрафиолетовым светом кварцевой лампы (в течение 1 мин на расстоянии 7,5 см от лампы). В результате все бактерии, кроме защищенной ртутью, погибают. Через сутки из уцелевшей клетки развивается колония, которую пересевают в жидкую среду.

Капельный метод Линднера
Для обеспечения одноклеточной изоляции применяют прерывистое распределение микробной взвеси на покровном стекле. При помощи чертежного пера на поверхность покровного стекла, находящегося в вертикальном положении, наносят несколько рядов микрокапель (обычно три ряда по четыре капли
в каждом) очень разведенной микробной взвеси. После быстрого нанесения капель покровное стекло каплями вниз немедленно накладывают на углубление предметного стекла и закрепляют, обмазывая края вазелином.
При просмотре препарата под микроскопом отмечают капли, содержащие по одной клетке. Затем препараты помещают в термостат на одни-двое суток до развития в каплях колоний. Перенос материала из отмеченных капель осуществляется путем прикасания к ним стерильных фильтровальных бумажек, которые помещают в пробирки с жидкой питательной средой, где и происходит дальнейшее развитие одноклеточной микробной культуры.
Микрокапли можно наносить не только чертежным пером, но также при помощи микропетли диаметром 0,5–0,75 мм, сифона, изготовленного из капиллярной трубочки или микропипетки.

Модификация капельного метода Бурри
Автор вместо водной взвеси предложил тушевую взвесь бактериальных клеток. Для этого «китайскую» тушь разбавляют водой в десять раз, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют 30 мин при давлении в 1,5 атм. Затем туши дают отстояться в течение двух недель, чтобы все частички осели и не мешали микроскопированию.
Прокаленной петлей из верхнего слоя разведенной туши наносят четыре большие капли на предметное стекло. В первую каплю платиновой петлей вносят ничтожное количество исследуемых бактерий и тщательно смешивают их с тушью, затем петлю переносят во вторую каплю, третью и четвертую. Из четвертой капли чертежным пером осторожно наносят ряд отдельных точек на поверхность желатины в чашки Петри. Каждую точку накрывают стерильным покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. Благодаря туши бактерии хорошо видны. Отмечают стеклышки, под которыми обнаружена только одна бактерия. Развившиеся из отдельных клеток колонии отсевают на соответствующие питательные среды.
Пэн и Рамчаданни (1929) внесли свое изменение в метод Бурри, использовав вместо туши нигрозин.

Капиллярный метод Мара
Автор предлагает применять капилляры для изоляции одной клетки бактерий. Для этой цели используют тонкие трубочки диаметром 200–300 мк, которые получают путем оттягивания пастеровских пипеток на микропламени горелки. Отрезки капилляров хранят с запаянными концами. 0,01 мл исходной суспензии (1 : 500000000) разводится в 1 мл бульона. Подобное разбавление производят еще дважды, после чего из третьей пробирки берут 0,1 мл суспензии и вливают в 1 мл смеси расплавленного агара (3%) и желатины (10%) поровну с бульоном. Пробирки с этой взвесью помещают в воду при 40° С. Перед заполнением капилляров у них обламывают оба конца, а после заполнения вновь запаивают. После промывки капилляры помещают на чистое предметное стекло и рассматривают в микроскоп. Отмечают отдельные клетки, после чего капилляры помещают в термостат на 5–8 час. Поверхность капилляров с развившимися микроколониями обеззараживают, затем отламывают их концы и помещают в бульон.
Достоинством капиллярного метода является удобное для микроскопирования пространство, в котором заключена микробная взвесь, а также лучшая защищенность от испарения и внешнего загрязнения. Однако основной причиной, ограничивающей применение указанного метода, является искажение изображения микробных тел, рассматриваемых в цилиндрических капиллярах.