Способы определения количества клеток в тканях растения-хозяина

01.02.2014

Метод Эллингтона и Чемберлена. Установление способности бактерий к размножению в тканях растения-хозяина можно проводить на специально зараженных растениях. Для этой цели используют обычно метод пропитывания листовой пластинки растения бактериальной суспензией. По методу Эллингтона и Чемберлена, например, для заражения листьев фасоли и сои P. glycinea Соеrреr их опрыскивают сильной струей стерильной водопроводной воды до тех пор, пока не наступает видимое на глаз пропитывание водой межклеточных пространств. Затем листья немедленно погружают на 1 мин в бактериальную суспензию P. glycinea, содержащую 8 млн. клеток в 1 мл воды. Суспензия готовится из односуточной агаровой культуры. Через 3 мин листья промывают пятью порциями стерильной воды с целью удаления оставшихся на поверхности бактериальных клеток.
Заражение листьев фасоли X. phaseoli авторы проводили методом пропитывания листьев бактериальной суспензией при помощи пульверизатора. В опытах использовали по шесть растений для каждого варианта. Для заражения отбирали по возможности одинаковые по расположению на растениях и по возрасту листочки (обычно в фазе первых тройчатых листьев). Из зараженных растений вырезали диски диаметром 4 мм при помощи острого бурава для пробок. Шесть дисков тщательно растирали с 10 мл стерильной воды и оставляли стоять в течение 1 час, периодически встряхивая. Затем готовили соответствующее разведение в стерильной воде. Посев 1 мл определенного разведения в чашку Петри с последующим добавлением картофельно-декстрозного агара проводили в восьми повторениях. Подсчет колоний P. glycinea проводили через четыре и пять дней, а X. phaseoli – шесть-семь дней после посева. Первые образцы листьев брали через 1 час после заражения, а затем ежедневно в течение семи дней.
Метод Кори и Старра
Авторы несколько видоизменили описанный выше метод. Для заражения листьев фасоли X. phaseoli 10 мл двухсуточной культуры смешивали с 1 г стерильного карборунда. Приготовленную смесь наносили на поверхность листьев при помощи ватного тампона. Зараженные растения выдерживали в специальных камерах с относительной влажностью выше 90% при 22° С. Перед взятием образцов авторы стерилизовали листья погружением их в 0,1%-ный «Rossal» на 5 мин и прополаскивали в пяти порциях 100 мл дистиллированной стерильной воды. В 10 мл стерильной воды размягчали десять дисков по 4 мм в диаметре, тщательно встряхивая и оставляя стоять на 1 час. Посев 0,1 мл разведенной соответствующим образом приготовленной болтушки наносили на поверхность агаровой пластинки, тщательно растирая для равномерного распределения посевного материала. Повторность опыта трехкратная. Подсчет колоний производили через шесть дней после инкубации в термостате.
Метод Шарена
По указанному методу бактериальную взвесь X. phaseoli для заражения растении отмывали от среды дистиллированной водой, затем доводили до нужного разведения по стандарту мутности. Заражение проводили путем опрыскивания растений бактериальной взвесью, пропитывая ею межклеточное пространство. В данном случае образцы зараженных листьев отбирали таким образом, чтобы в исследование были взяты листья из трех различных ярусов. Такой метод отбора образцов давал возможность компенсировать различие между растениями и различие в возрасте на любом растении. В 10 мл стерильной дистиллированной воды мацерировали 18 дисков (по 4 мм в диаметре) – по 6 из каждого из трех листиков. В дальнейшем поступали так же, как и при предыдущих исследованиях.
Заражение листьев возбудителем бактериальной рябухи табака P. tabacum. можно проводить при помощи инъекций в жилки шприцем. Видимая пропитываемость межклеточного пространства достигалась вытеснением из него воздуха быстро поступающей бактериальной суспензией. Этим способом можно ввести инфекционное начало в любой участок листа между боковыми жилками. После этого один диск диаметром 5,5 мм помещали в стерильную пробирку в каплю стерильной воды и измельчали стерильной палочкой. После добавления 1 мл стерильной воды исследуемый материал тщательно растирали и оставляли стоять 15 мин. Методика подсчета количества клеток та же.