Изучение биохимических свойств фитопатогенных бактерий является обязательным при определении их родовой, видовой и типовой принадлежности. Для выявления и изучения этих свойств исследуемую культуру бактерий засевают на среды, в состав которых входят различные углеводы, белки и другие вещества. В некоторые из них вводят индикатор, который указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления и восстановления введенного в среду вещества.
Свойство расщеплять углеводы присуще многим фитопатогенным бактериям. Под действием сахаролитических ферментов этих бактерий углеводы расщепляются на альдегиды и кислоты с образованием в конечном итоге углекислоты и воды. Для обнаружения сахаролитических свойств исследуемую культуру бактерий засевают на специальные питательные среды, известные в лабораторной практике под названием «цветных» рядов. Для приготовления этих сред в качестве основы используют среду Гисса, синтетическую среду Омелянского и некоторые другие. В отделе фитопатогенных бактерий Института микробиологии и вирусологии АН УССР для этого применяется синтетическая среда Омелянского с добавлением в качестве индикатора бромтимол-бляу. Мясной бульон для этой цели не пригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к неправильным результатам.
Приводим методику приготовления среды Гисса: к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона, 0,5 г поваренной соли. Пептон и соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр так, чтобы раствор был совершенно прозрачный, устанавливают pH 7,0–7,4, прибавляют 0,5 г любого из применяемых углеводов, а также соответствующее количество одного из индикаторов – Андреде, бромтимол-бляу, лакмусовую настойку и др.
Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, предварительно простерилизованные вместе с поплавками, опущенными запаянными концами кверху. Среду стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или однократно 20 мин при 112° С. Во время стерилизации поплавки заполняются доверху питательной средой.
Посев фитопатогенных бактерий на среды Гисса производят односуточной культурой, снятой петлей с агарового косяка, либо бактериальной суспензией определенной плотности. После инкубации в термостате учитывают результаты ферментации углеводов на 2, 4, 7 и 10-й день, отмечая начало кислото- и газообразования. Образование кислоты или щелочи в пробирках сопровождается изменением цвета питательной среды и обозначается в зависимости от результатов буквой К (кислота) или буквой Щ (щелочь). Кислотообразование, сопровождающееся появлением пузырьков газов в поплавке обозначают буквами КГ. При длительном выдерживании посевов в термостате может произойти изменение кислой реакции среды в щелочную. Это объясняется использованием бактериями углерода аминокислот, выделением свободной аминогруппы, которая и дает нейтральную или слабощелочную реакцию.
В обычной практической работе для выявления сахаролитических свойств бактерий используют глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу и маннит. Однако результаты исследования фитопатогенных бактерий показывают, что иногда набор углеводов следует значительно расширить. В руководстве по микробиологическим методам, изданном обществом американских бактериологов (1957), рекомендуется использовать следующие углеводы, спирты и глюкозиды.

Методика приготовления индикаторов. Индикатор Андреде – 0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл дистиллированной воды, прибавляют 16,4 мл нормального раствора едкого натрия. Раствор стерилизуют при 100° С в течение 5 мин и сохраняют в темном месте в флаконе с притертой пробкой. Индикатор имеет соломенно-желтый цвет. При смещении pH в кислую зону индикатор Андреде приобретает ярко-малиновую окраску.
Индикатор бромтнмол-бляу – 0,4 г бромтимолбляу растворяют в 40 мл дистиллированной воды, нагревая ее до кипения. После этого к раствору прибавляют 6,4 мл децинормального раствора едкого натрия (жидкость при этом приобретает зеленоватый цвет), доливают дистиллированной водой до 100 мл и хранят в темном месте в склянке, закрытой притертой пробкой. К среде этот реактив добавляют в количестве 1–2%. Бромтимол-бляу можно добавлять к средам в виде спиртового раствора – на 1 л среды рекомендуется добавлять 1,6% спиртового раствора индикатора. При помощи бромтимол-бляу можно определить изменение реакции среды в пределах pH 6,0–7,6. При щелочной реакции среда имеет синий цвет, при кислой – желтый и при нейтральной – травянистый оттенок. В тех случаях, когда хотят охватить более широкий диапазон pH (5,0–8,0), применяют смесь бромкрезол-пурпура и крезол-рота (по 0,5 мл 1,6%-ного каждого спиртового раствора на 1 л среды).
Лакмусовая настойка по Кальметту, Негру и Бока – 100 г лакмуса измельчают и кипятят в 85%-ном спирте, после чего спирт сливают. Порошок собирают на куске полотна, смешивают с 500 мл воды, кипятят в выпарительной чашке, фильтруют через бумагу. К фильтрату добавляют равный объем 85%-ного спирта и делят на две равные части. К одной половине жидкости добавляют по каплям соляную кислоту до тех пор, пока жидкость не станет почти красной и только тогда добавляют другую половину настойки.
Сахаролитические свойства фитопатогенных бактерий можно выявить при изучении способности у них разлагать крахмал. Крахмал – полисахарид, находящийся в растительных клетках, разлагается сравнительно небольшим количеством бактерий. Такие бактерии обладают обычно мощным комплексом ферментов, под действием которых происходит гидролиз крахмала на декстрин и мальтозу, а затем – глюкозу. Эти свойства наблюдаются и у некоторых фитопатогенных бактерий. Для выявления способности у бактерий гидролизировать крахмал их высевают штрихами на твердую питательную среду, содержащую растворимый крахмал и выдерживают в термостате семь дней. В результате гидролиза крахмала вокруг таких штрихов образуется светлая зона (ореол), хорошо заметная, если чашки залить раствором йода или Люголя, окрашивающим среду в синий цвет. Если гидролиз крахмала дошел до стадии образования декстринов, то ореолы окрашиваются в красновато-бурый цвет, если же крахмал перешел в сахар, то они остаются бесцветными.
Рецепт применяемой среды: к 1 л расплавленного горячего мясопептонного агара прибавляют 0,5 г растворимого крахмала, предварительно размешанного в небольшом количестве воды, и хорошо перемешивают. После этого агар разливают в пробирки или сотки и стерилизуют в течение 30 мин под давлением 1 атм.
О сахаролитических свойствах бактерий можно судить также и по их поведению на молоке. Под влиянием фитопатогенных бактерий в молоке могут происходить следующие изменения – свертывание, пептонизация, свертывание + пептонизация, либо молоко может оставаться без изменения. Кроме того, на молоке может наблюдаться образование пигмента. Для обнаружения у бактерий способности свертывать молоко его необходимо слегка подогреть на пламени горелки. Изменения, происходящие в молоке под влиянием фитопатогенных бактерий, следует регистрировать периодически. Первый раз записывают изменения на 1–2-й день, затем на 4, 10 и 21-й день. Свертывание молока может быть вызвано действием фермента бактерий, сбраживающего лактозу (молочный сахар), с образованием молочной кислоты, под влиянием которой белок молока (казеин) свертывается, образуя творожистую массу. Сгусток в дальнейшем не изменяется. Свертывание молока под влиянием протеолитического фермента может происходить с дальнейшей его пептонизацией. Отмечают начало и конец этого процесса. Пептонизация может происходить и без предварительного свертывания. При исследовании изменений молока отмечают его консистенцию – вязкую, тягучую, без изменений и цвет – бурый, синий, зеленый и др.

---

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Добавить