Методы изучения протеолитических свойств

01.02.2014

Для выявления протеолитических ферментов у фитопатогенных бактерий применяются белковые среды, не содержащие углеводов, – желатина, казеин и другие белки.
Посев на желатине производится уколом петли с культурой бактерий в середину столбика, не доходя немного до дна пробирки. Пробирки с посевом оставляют при комнатной температуре и просматривают их два-три раза в неделю. Протеолиз определяется по разжижению желатины. Этот процесс происходит по-разному – быстро или медленно. Отмечают также и характер разжижения. Оно бывает послойное, т. е. равномерное по всей ширине пробирки, реповидное, мешкообразное, воронко-, кратерообразное и др. Отмечают начало разжижения и его конец, а также образование газа.
Некоторые виды фитопатогенных бактерий с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада – индола, сероводорода, мочевины и аммиака. Для обнаружения этих продуктов производят посев изучаемых бактерий на бульон Готтингера, мясопептонный бульон или пептонную воду и после трехсуточного выдерживания в термостате исследуют образование продуктов распада белка при помощи соответствующих реактивов. Применяемые среды не должны содержать углеводов и, особенно, глюкозы, которая препятствуем образованию индола.
В литературе описаны несколько методов определения индола. Приводим описание некоторых из них.
Определение индола по Сальковскому заключается в том, что 5 мл недельной бульонной культуры бактерий нагревают с 4 мл 10%-ной серной кислоты, а затем прибавляют 0,5–2 мл 0,05%-ного раствора азотнокислого натрия и продолжают нагревание. При наличии индола появляется красно-фиолетовая окраска.
Для определения индола по Эрлиху исследуемую культуру засевают в 5 мл бульона Готтингера или мясопептонного бульона. К суточной культуре приливают 2–3 мл эфира. Смесь тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, затем в течение нескольких минут дают ей отстояться, в результате чего содержащийся в культуре индол экстрагируется эфиром и всплывает кверху. После этого осторожно по стенке пробирки наслаивают пять–восемь капель реактива Эрлиха и в течение 5 мин учитывают результат. Окрашивание эфирного слоя в малиново-розовый цвет свидетельствует о положительной реакции на индол.
В состав реактива Эрлиха входит парадиметиламидобензальдегид – 1 г, этиловый 96°-ный спирт – 95 мл, концентрированная соляная кислота – 20 мл. Перечисленные ингредиенты смешивают.
Ферлин и Карабинос применяли для определения индола реактив следующего состава: 0,25%-ный раствор ванилина и соляной кислоты (удельный вес 1,19). Этим реактивом можно обнаружить индол при наличии триптофана. С индолом реактив дает яркую оранжево-красную окраску, с триптофаном – фиолетовую.
Для определения индола по Легаль-Вайлю в пробирку с культурой прибавляют четыре-пять капель 5%-ного раствора нитропруссидного натрия, встряхивают и добавляют несколько капель 40%-ного раствора едкого натрия, а затем вносят несколько капель ледяной уксусной кислоты. При наличии индола происходит сине-зеленая окраска.
По способу Моррели полоски фильтровальной бумаги пропитывают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты, подсушивают их и подвешивают в засеянную пробирку таким образом, чтобы бумажка не прикасалась к среде. При наличии индола через один–три дня нижняя часть бумажки окрашивается в темно-розовый цвет.
Для определения сероводорода также существует несколько методов.
1. Петлю исследуемой культуры бактерий засевают в пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном Готтингера, затем опускают в эту пробирку фильтровальную бумажку, пропитанную насыщенным раствором уксуснокислого свинца, закрепляя ее пробкой. Если бактерии выделяют сероводород, то индикаторная бумага приобретает черно-бурую окраску. Индикаторная бумага на сероводород готовится таким образом: полоски фильтровальной бумаги шириной 5 мм смачивают в растворе, содержащем дистиллированной воды 100 мл, уксуснокислого свинца 20 г и двууглекислой соды 1 г. Бумагу высушивают в термостате в больших стерильных чашках и затем нарезают полосками длиной 5–6 см. Бумажки можно замачивать также и в насыщенном растворе уксуснокислого свинца.
2. Для определения сероводорода по Моррису производят укол в пробирку с питательным агаром, содержащим 0,1% уксуснокислого свинца. Укол лучше всего сделать между агаром и стенкой пробирки, чтобы яснее было видно почернение посевной линии.
Кроме того, в литературе описаны также и различные среды для определения способности бактерий образовывать сероводород. Приводим рецепты некоторых из них.
Свинцовый агар по Хоменко. К расплавленному слабощелочному мясопептонному агару (pH 7,4–7,6) добавляют 1 % уксуснокислого свинца и после охлаждения до 45° С – 2% яичного белка, взбалтывают, разливают в пробирки столбиком и стерилизуют в аппарате Коха при 100° С 30 мин в течение трех дней. Посев производят уколом в агар. Культура, образующая сероводород, уже через 4 час дает ясное потемнение среды по линии укола.
Свинцовый агар для определения сероводорода. Мясопептонный агар (pH 7,2–7,6), содержащий 4% пептона, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют. В каждую пробирку стерильного агара добавляют стерильно по 1 мл простерилизованного 0,25%-ного раствора уксуснокислого свинца, смешивают, дают застыть столбиком и проверяют на стерильность. Засев исследуемых культур производят уколом. Сероводород дает черноватый или буроватый цвет среды по уколу.