Каталаза

01.02.2014

Каталаза разлагает ядовитое для клеток вещество – перекись водорода на воду и кислород. Обладает пониженной термостойкостью, ее температурный оптимум лежит в пределах 0–10° С. Нейтральная реакция способствует сохранению каталазной активности.
Для определения каталазы культуру бактерий выращивают на картофельном агаре в течение 24–48 час при температуре 27° С. Смыв клеток производят фосфатным буфером (pH 7,0). Центрифугируют и тщательно промывают культуру два-три раза. Густую бактериальную массу растирают со стеклянным порошком, при этом ступку помещают в кювету со льдом. Стекло осаждают центрифугированием, в опыт берут прозрачную надосадочную жидкость, для контроля ее кипятят или выдерживают в кипящей водяной бане 5 мин.
Приводим два способа определения наличия каталазы.
1. Определение каталазы по А.Н. Баху и А.И. Опарину проводят таким образом. К 20 мл прозрачной надосадочной жидкости (опытной и контрольной) прибавляют 20 мл воды и 3 мл 1%-ной Н2O2 (если нужно, то нейтрализуют слабой щелочью – 0,1-н. NaOH) и ставят на 15–30 мин в кюветку со льдом. По истечении определенного срока (15–30 мин в зависимости от активности фермента) в обе колбочки приливают по
5 мл 10%-ной H2SO4 и оставшуюся неразложенной Н2О2 оттитровывают 0,1-н. КМnO4.
Активность каталазы вычисляется по разности в миллилитрах 0,1-н. КМnO4, использованных на титрование контрольной и опытной проб. Активность фермента можно выразить непосредственно в миллилитрах КМnO4 или в миллиграммах разложенной Н2О2, исходя из того, что 1 мл 0,1-н. раствора КМnO4 соответствует 1,7 мг H2O2. Количество разложенной перекиси водорода в миллиграммах будет равняться С = (А–В) • f • 1,7, где А – количество 0,1-н. раствора КМnO4, затраченное на титрование контроля, В – количество 0,1-н. раствора КМnO4, затраченное на титрование пробы, f – коэффициент поправки 0,1-н. раствора КМnO4.
2. йодометрический метод определения каталазы основан на титровании гипосульфитом перекиси водорода, разложенной каталазой бактерий. Определение производят следующим образом. 50 мл 0,01-н. Н2O2 в 0,006М фосфатном буфере (pH 6,8) выдерживают при 0° С, затем добавляют 1 мл фильтрата из бактерий, быстро смешивают и отмечают начальный момент реакции. После этого сразу же берут пипеткой 5 мл и сливают в заранее заготовленную колбу с 5 мл 10%-ной H2SO4. Пробы по 5 мл берут через 3, 6, 12 мин, сливая их в колбы с 5 мл 10%-ной H2SO4. Титрование производят так: в каждую колбу добавляют 10 мл 10%-ного свежеприготовленного KJ и одну каплю 1%-ного молибдата аммония (в качестве ускорителя), хорошо смешивают и через 3 мин титруют выделившийся йод 0,01-н. гипосульфитом, добавляя растворимый крахмал перед самым концом титрования. По разности в миллилитрах гипосульфита можно судить о ферментативной активности взятого материала. Можно ограничиться только двумя определениями – в начале реакции и после ее окончания, например через 15 мин. Контролем служит такая же смесь, но с кипяченным экстрактом. Активность каталазы условно выражается в миллилитрах 0,01-н. раствора гипосульфита. Активность ее в миллиграммах, расщепленной H2O2, будет равна С = (А–В) ∙ f ∙ 0,17, где А – количество 0,01-н. раствора гипосульфита, затраченное на титрование контроля, В – количество 0,01-н. раствора гипосульфита, затраченное на титрование пробы, f – коэффициент поправки на 0,01-н. раствора гипосульфита.