Пероксидаза

01.02.2014

Пероксидаза при наличии перекиси водорода катализирует окисление ряда фенолов и ароматических аминов с образованием различных продуктов. Оптимум pH для пероксидазы несколько меняется в зависимости от взятых субстратов, однако в большинстве случаев опыты проводят при нейтральной или слабощелочной реакции и температуре около 20° С.
Качественное определение пероксидазы сводится к тому, что к исследуемому материалу (полученному после растирания бактериальной массы со стеклом) приливают 1 мл 1%-ного раствора гваякола и 1%-ного раствора Н2О2. Через некоторое время фильтрат принимает усиливающийся оттенок чайного настоя (образуется тетрагваяхинон).
Количественное определение пероксидазы основано на окислении пирогаллола пероксидазой при наличии перекиси водорода до пурпурогаллина, нерастворимого в воде вещества темнокрасного цвета.
Определение пероксидазы по А.Н. Баху и Б.И. Збарскому заключается в следующем: к 10 мл свежеприготовленного 1%-ного пирогаллола добавляют 1 мл 1%-ной перекиси водорода, выдерживают при 20–25° С и к этой же смеси приливают 40 мл исследуемого материала, прогретого до той же температуры. Полученную смесь ставят в термостат или водяную баню (при 20–25° С) на различные сроки, в зависимости от действия фермента. Через определенный срок в опытную колбу прибавляют 1–2 мл концентрированной серной кислоты. Контроль ставится так же, но в данном случае серную кислоту прибавляют немедленно после добавления исследуемого материала. В ходе работы в обеих колбах выпадает осадок бурого цвета, причем в опыте значительно больший. Осадки отфильтровывают на тиглях Гуча с асбестов или в трубках, служащих для определения сахаров по Бертрану, и промывают холодной водой до тех пор, пока промывная вода перестанет восстанавливать перманганат. Затем осадок пурпурогаллина количественно растворяют на фильтре крепкой серной кислотой (10–20 мл), прибавляя ее малыми порциями. Количество взятой воды должно в семь–десять раз превышать объем кислоты; при меньшем разбавлении трудно провести титрование, а при чрезмерном – пурпурогаллин выпадает в осадок. Полученные растворы пурпурно-красного цвета титруют 0,1-н. перманганатом, в результате чего жидкость почти обесцвечивается, приобретает розовый оттенок, но эта окраска быстро исчезает. Титрование ускоряется подогреванием жидкости до 60–70° С, на конец которого указывает наступление розовой окраски раствора, не исчезающей в течение 30 сек. Разность между количеством потребленного перманганата в основном и контрольном опытах является показателем активности пероксидазы.
Определение активности пероксидазы по Вильштеттеру (модификация Белозерского) проводят таким образом. В колбу емкостью 250 мл помещают 190 мл дистиллированной воды, 10 мл свежеприготовленного 5%-ного раствора пирогаллола и 1 мл 0,5%-ной перекиси водорода. Эту смесь выдерживают при 20° С, после чего к смеси приливают 1,5 мл испытуемого экстракта, хорошо встряхивают и ровно через 5 мин действие фермента прекращают добавлением 5 мл 10%-ной серной кислоты. Образовавшийся пурпурогаллин извлекают из смеси многократным взбалтыванием ее с эфиром. Содержимое колбы переливают в делительную воронку, колбу ополаскивают несколько раз эфиром (всего 25 мл) и сливают в ту же воронку. Экстрагирование эфиром продолжают почти до полного извлечения пурпурогаллина. Эфирные вытяжки соединяют вместе, фильтруют их через бумажный фильтр в сухую мерную колбу (50 мл), которую доводят до метки эфиром. Этот раствор сравнивают в фотоэлектроколориметре со стандартным эфирным раствором, содержащим 5 мг пурпурогаллина в 50 мл эфира. В качестве стандарта при колориметрировании можно применять водный раствор двухромовокислого калия (0,75 г К2Сr2О7 в 1 л 0,5-н. НСl).