Новости
27.03.2024 27.03.2024 26.03.2024 |
Дегидразы (дегидрогеназы)01.02.2014
Дегидразы, или дегидрогеназы, – ферменты, участвующие в процессе дыхания и окисляющие субстраты путем отщепления водорода. Некоторые дегидразы могут переносить водород непосредственно на молекулярный кислород, другие – только на какие-либо акцепторы (метиленовая синь, тионин и др.). Большинство дегидраз переносят водород при наличии кодегидразы I или кодегидразы II. В состав кодегидразы I входит молекула амидоникотиновой кислоты, молекула аденина, две молекулы фосфорной кислоты и две молекулы d-рибозы. Наличие дегидрогеназ можно определить при помощи солей тетразолия, которые превращаются под действием дегидраз в соответствующие формазаны. Количество последних прямо пропорционально количеству мобилизованного водорода. Определение заключается в следующем. К 1 мл бактериальной суспензии прибавляют 1,5 мл 1/15М фосфатного буфера pH 7,6 по Серенсену. При определении активности какой-либо дегидрогеназы прибавляется 1 мл 0,1М раствора соответствующего субстрата (сахара, спирты, кислоты и др.), затем к указанной смеси добавляют 0,5 мл 0,5%-ного свежеприготовленного водного раствора ТТХ (трифенилтетразолиумхлорид). Содержимое пробирок взбалтывают, инкубируют в течение 24 час при 25° С. Извлекают образовавшийся ТФФ (трифенилформазан) ледяной уксусной кислотой в 1,5-кратном объеме к количеству реагирующей смеси (5–6 мл). Формазан экстрагируют из уксуснокислого раствора 5 мл толуола при сильном встряхивании. Закрытые пробирки отстаивают в течение суток, после чего приступают к фотоколориметрированию окрашенного толуолового слоя, используя 10-миллиметровые кюветы и синий светофильтр. Стандартный раствор изготовляют из трифенилформазана, который можно получить, восстанавливая трифенилтетразолиумхлорид гидросульфитом натрия. Полученный формазан растворяют в разбавленной (~60%) ледяной уксусной кислоте и экстрагируют его из определенного объема раствора 5 мл толуола. Составляют кривую от 5 до 100 мкг формазана. Активность дегидрогеназ определяют молекулярной реакцией: для образования 1 мг ТФФ из ТТХ требуется 6,709 мкг Н+. Вместо уксусной кислоты и толуола извлечение формазана можно проводить ацетоном. При этом в пробирку с исследуемой смесью добавляют 7 мл ацетона, встряхивают и оставляют на 10 мин. Верхнюю часть жидкости центрифугируют, а прозрачную жидкость колориметрируют. Для приготовления стандартной кривой формазан (от 10 до 100 мкг) растворяют в ацетоне. Известны и более простые методы определения активности дегидрогеназ с применением метиленовой сини и использованием обычных пробирок без откачивания. Ниже приводится модификация способа, применяемого для бактериальных суспензий. В обычную пробирку помещают 0,5 мл субстрата и 0,5 мл 1 : 4000 метиленовой сини. Добавляют 2 мл 2%-ного агара, приготовленного на 0,5%-ном К2НРО4, который расплавляют и охлаждают до 45° С. Затем вносят 1 мл клеточной суспензии, смешивают и охлаждают на ледяной бане до затвердевания (1–2 мин). Ставят пробирку на водяную баню при 37–40° С и определяют время, требующееся для восстановления. В результате диффузии кислорода из воздуха в верхней части содержимого пробирки образуется зона (2–3 мл) и получается резкий контраст по сравнению с находящейся ниже обесцвеченной зоной. При определении наличия дегидрогеназ у бактерий применяют также 0,8%-ный «голодный агар», которым заливают содержимое обычной пробирки. «Голодный агар» готовят следующим образом: навеску агара промывают сначала проточной водой в течение суток, затем несколько раз дистиллированной водой, кипятят до образования гомогенного раствора, фильтруют и разливают в колбочки. Перед употреблением агар расплавляют в водяной бане и употребляют при охлаждении его до 45° С. Содержимое пробирки (субстрат, метиленовая синь, бактериальная взвесь) взбалтывают и сверху наслаивают 3–4 мл расплавленного и охлажденного до 45° С агара. При этом образуется плотная воздухонепроницаемая пленка. Пробирки помещают в водяную баню при 37° С и отмечают скорость обесцвечивания метиленовой сини. |