Новости

Дегидразы (дегидрогеназы)

01.02.2014

Дегидразы, или дегидрогеназы, – ферменты, участвующие в процессе дыхания и окисляющие субстраты путем отщепления водорода. Некоторые дегидразы могут переносить водород непосредственно на молекулярный кислород, другие – только на какие-либо акцепторы (метиленовая синь, тионин и др.). Большинство дегидраз переносят водород при наличии кодегидразы I или кодегидразы II. В состав кодегидразы I входит молекула амидоникотиновой кислоты, молекула аденина, две молекулы фосфорной кислоты и две молекулы d-рибозы.
Кодегидраза II состоит из двух молекул пантозы, амидоникотиновой кислоты, трех молекул фосфорной кислоты и аденина. Дегидразы носят различные наименования в зависимости от дегидрируемого ими субстрата, например алкогольдегидраза, лактикодегидраза, глютамикодегидраза и др.
Принцип определения дегидраз основан на восстановлении бактериальными экстрактами, содержащими фермент, индикаторов за счет отщепления водорода от соответствующих субстратов. Такие опыты ставят обычно в анаэробных условиях, причем удобнее всего в специальных трубках Тунберга.
Для определения активности дегидрогеназ культуру бактерий выращивают в матрацах на картофельном агаре в течение 24–48 час при 27° С. Затем бактерии смывают фосфатным буфером с pH 7,0, центрифугируют и трижды промывают. Разведение бактериальных клеток должно быть таким, при котором клетки на соответствующем субстрате (глюкозе) будут восстанавливать метиленовую синь за 15–30 мин. Для фитопатогенных бактерий это 5 млрд. клеток в 1 мл. Для получения ферментных вытяжек бактериальную массу растирают в фарфоровой ступке со стеклянным порошком с прибавлением от 5 до 20 мл 0,87%-ного раствора К2НРО4 на 1 г материала. Растертый материал ставят в кювету со льдом на 30 мин и периодически перемешивают. Охлажденный материал центрифугируют и прозрачный центрифугат сразу же берут для исследования. Определение следует проводить только в свежих образцах, так как при стоянии на холоду активность дегидрогеназ падает.
Акцептором водорода при определении дегидрогеназ в большинстве случаев является метиленовая синь в различных концентрациях (1 : 10000; 1 : 20000). Субстратами (донаторы водорода) могут служить вещества самой разнообразной природы (углеводы, аминокислоты, органические кислоты и др.). Донаторы водорода применяют в концентрации 0,1М растворов в количестве 1–2 мл. При использовании органических кислот их необходимо нейтрализовать КОН. NaOH задерживает действие дегидраз.
Определение дегидраз по методу Тунберга (рис. 49) заключается в том, что в пробирку вносят 2–4 мл исследуемого материала, а в шарик – 1–2 мл 0,1 М раствора субстрата и 1 мл метиленовой сини в разведении 1 : 20 000. Пробирку осторожно, чтобы не опрокинуть шарик, закрывают пробкой, перед этим смазывают шлиф. Повернув кран, присоединяют пробирку к водоструйному или масляному насосу. До начала кипения жидкости откачивают воздух 3 мин. Не прекращая откачивания, закрывают кран и отсоединяют насос. Пробирки ставят в водяную баню с постоянной температурой (37° С) и через 10 мин, наклонив пробирку, смешивают содержимое шарика и пробирки и отмечают время. Когда метиленовая синь полностью обесцветится, еще раз отмечают время. Для визуального наблюдения в опыт включают также пробирку, содержащую все компоненты исследуемой системы (бактериальной суспензией, инактивированной прогреванием), но с метиленовой синью в концентрации 1/10 от обычной. Эта пробирка соответствует 90% восстановления метиленовой сини. Когда в опытных пробирках интенсивность окраски сравняется с этим стандартом, этот момент отмечается как время окончания реакции.

Дегидразы (дегидрогеназы)

Наличие дегидрогеназ можно определить при помощи солей тетразолия, которые превращаются под действием дегидраз в соответствующие формазаны. Количество последних прямо пропорционально количеству мобилизованного водорода.
Определение заключается в следующем. К 1 мл бактериальной суспензии прибавляют 1,5 мл 1/15М фосфатного буфера pH 7,6 по Серенсену. При определении активности какой-либо дегидрогеназы прибавляется 1 мл 0,1М раствора соответствующего субстрата (сахара, спирты, кислоты и др.), затем к указанной смеси добавляют 0,5 мл 0,5%-ного свежеприготовленного водного раствора ТТХ (трифенилтетразолиумхлорид). Содержимое пробирок взбалтывают, инкубируют в течение 24 час при 25° С. Извлекают образовавшийся ТФФ (трифенилформазан) ледяной уксусной кислотой в 1,5-кратном объеме к количеству реагирующей смеси (5–6 мл). Формазан экстрагируют из уксуснокислого раствора 5 мл толуола при сильном встряхивании. Закрытые пробирки отстаивают в течение суток, после чего приступают к фотоколориметрированию окрашенного толуолового слоя, используя 10-миллиметровые кюветы и синий светофильтр. Стандартный раствор изготовляют из трифенилформазана, который можно получить, восстанавливая трифенилтетразолиумхлорид гидросульфитом натрия. Полученный формазан растворяют в разбавленной (~60%) ледяной уксусной кислоте и экстрагируют его из определенного объема раствора 5 мл толуола. Составляют кривую от 5 до 100 мкг формазана. Активность дегидрогеназ определяют молекулярной реакцией: для образования 1 мг ТФФ из ТТХ требуется 6,709 мкг Н+.
Вместо уксусной кислоты и толуола извлечение формазана можно проводить ацетоном. При этом в пробирку с исследуемой смесью добавляют 7 мл ацетона, встряхивают и оставляют на 10 мин. Верхнюю часть жидкости центрифугируют, а прозрачную жидкость колориметрируют. Для приготовления стандартной кривой формазан (от 10 до 100 мкг) растворяют в ацетоне.
Известны и более простые методы определения активности дегидрогеназ с применением метиленовой сини и использованием обычных пробирок без откачивания. Ниже приводится модификация способа, применяемого для бактериальных суспензий. В обычную пробирку помещают 0,5 мл субстрата и 0,5 мл 1 : 4000 метиленовой сини. Добавляют 2 мл 2%-ного агара, приготовленного на 0,5%-ном К2НРО4, который расплавляют и охлаждают до 45° С. Затем вносят 1 мл клеточной суспензии, смешивают и охлаждают на ледяной бане до затвердевания (1–2 мин). Ставят пробирку на водяную баню при 37–40° С и определяют время, требующееся для восстановления. В результате диффузии кислорода из воздуха в верхней части содержимого пробирки образуется зона (2–3 мл) и получается резкий контраст по сравнению с находящейся ниже обесцвеченной зоной.
При определении наличия дегидрогеназ у бактерий применяют также 0,8%-ный «голодный агар», которым заливают содержимое обычной пробирки. «Голодный агар» готовят следующим образом: навеску агара промывают сначала проточной водой в течение суток, затем несколько раз дистиллированной водой, кипятят до образования гомогенного раствора, фильтруют и разливают в колбочки. Перед употреблением агар расплавляют в водяной бане и употребляют при охлаждении его до 45° С.
Содержимое пробирки (субстрат, метиленовая синь, бактериальная взвесь) взбалтывают и сверху наслаивают 3–4 мл расплавленного и охлажденного до 45° С агара. При этом образуется плотная воздухонепроницаемая пленка. Пробирки помещают в водяную баню при 37° С и отмечают скорость обесцвечивания метиленовой сини.


Имя:*
E-Mail:
Комментарий: