Новости
17.04.2024 17.04.2024 17.04.2024 |
Методы изучения витаминов у фитопатогенных бактерий01.02.2014
Для роста и развития фитопатогенных бактерий необходимы витамины, которые они могут и сами синтезировать. Определение витаминов, продуцируемых изучаемыми бактериями, основывается на особой чувствительности некоторых микроорганизмов к наличию в среде тех или иных витаминов. Методика этих исследований заключается в следующем. Опыты ставят на глюкозо-минеральной среде Ридера без аспарагина такого состава: глюкозы – 5 г; (NH4)2SO4 – 3 г; К2НРO4 – 1 г; MgSO4 – 0,7 г; КН2РO4 – 1 г; NaCl – 0,5 г; Ca(NO3)2 – 0,4 г; дистиллированной воды – 1000 мл; рН7,2– 7,4. Для разрушения клеток изучаемых бактерии и освобождения белково-витаминного комплекса среду Ридера с находящимися в ней клетками бактерий подвергают различной обработке: при определении биотина – В1 никотиновой и пантотеновой кислот пользуются текучим паром, а при определении В12 – автоклавируют при 1,5 атм в течение 15 мин при наличии стабилизатора (5%-ный раствор нитрата натрия) и растворителя (1%-ный раствор лимоннокислого натрия). Затем в среду Ридера с находящимися в ней изучаемыми бактериями засевают микробы-индикаторы и по истечении определенного времени по увеличению веса микроорганизма-индикатора судят о наличии тех или иных витаминов в среде. Определение витамина В1 производят при помощи микроорганизма-индикатора Phycomyces nitens. Среда для выращивания этого гриба имеет следующий состав: MgSO4 – 0,5 г; КН2РO4 – 1,5 г; аспарагин – 2–4 г; глюкоза – 10–15 г; вода дистиллированная – 1000 мл. Изучаемые бактерии выращивают на среде Ридера, которая кроме глюкозы не должна содержать аспарагина и других органических соединений;: после инкубации и определенной обработки засевают спорами гриба Ph. nitens. После десятисуточного культивирования в термостате при 27° С мицелий гриба отделяют от культуральной жидкости, высушивают до постоянного веса и взвешивают. Для количественного определения витамина B1 используется стандартный раствор витамина B1 (0,5 мгк/мл). Учет производится по сравнению веса мицелия гриба, выросшего при наличии убитой культуры бактерий, и кристаллического витамина B1. Для определения биотина используют микроорганизм-индикатор Saccharomyces ellipsoideus штамм 465. Перед постановкой опыта культуру дрожжей этого микроорганизма-индикатора трижды пассируют на среде Ридера, освобожденной от биотина. Дрожжи, полученные таким способом, в количестве 10–15 клеток в 1 мл среды вносят в среду Ридера с имеющимися там клетками изучаемых бактерий. Учет размножения дрожжей производят после 96-часового культивирования в термостате при 27° С при подсчете в камере Тома. Для количественного учета применяют стандартный раствор биотина, концентрация которого составляет 0,001 мкг/мл. Витамин В12 определяют при помощи бактерий Escherichia coli Сastеllani and Chalmers штамм 113–3 чашечным методом по С.М. Чайковской и Е.Н. Дружининой. Для этого суточную культуру Е. coli штамм 113–3 выращивают на твердой питательной среде следующего состава: пептона – 20 г, NaCl – 5 г, агар-агара – 18 г на 1 л дистиллированной воды, pH 7,0. Затем смывают культуру и разводят ее физиологическим раствором до 1–2 млрд. в 1 мл. Этой взвесью культуры Е. coli штамм 113–3 засевают среду № 4 следующего состава: NH4Cl – 3 г, NaCl – 3 г, К2НРО4 – 0,4 г, лимоннокислого натрия – 3 г, лактозы – 3 г, глюкозы – 10 г, агар-агара – 15 г на 1 л дистиллированной воды, pH 7,0. Эту среду разливают в чашки Петри по 10–15 мл. После остывания агара в чашке на его поверхности расставляют по шесть цилиндриков. В два из них наливают 1 мл стандартного раствора витамина В12 (0,05 мкг/мл), а в остальные – такое же количество исследуемых образцов соответствующего разведения. В качестве стандарта применяется препарат кристаллического витамина В12 в ампулах с содержанием 16,4 мкг витамина В12 в 1 мл. Стандартные испытуемые образцы растворяют в 1%-ном растворе лимоннокислого натрия (для нейтрализации). Для получения наиболее точных определений концентрации B12 рабочее разведение должно содержать не более 0,1 мкг/мл и не менее 0,01 мкг/мл, причем концентрация второго разведения должна быть в два раза меньше первого. После инкубации в термостате при 37° С в течение 16–18 час зоны имеют хорошо очерченные края. Измеряют диаметр зон роста для каждой концентрации испытуемого стандартного раствора витамина В12 и выводят средние арифметические величины. Расчет концентрации витамина В12 производят по специальным таблицам расчета активности антибиотических препаратов, составленных во ВНИИА. Микробом-индикатором на никотиновую кислоту служит Zygosaccharomyces штамм 734. Опыт ставят на среде Ридера без аспарагина, к 1 л которого добавляют инозит – 5 мг, тиамин – 1 мг, пантотеновую кислоту – 0,25 мг, пиридоксин – 0,25 мг и биотин – 0,001 мкг. Перед постановкой опыта культуру дрожжей трижды пассируют на указанной среде, так как для своего роста этот микроорганизм нуждается не только в том витамине, для которого он является индикатором, но и в некоторых других, которые необходимо внести в среду. В среду Ридера указанного состава с клетками изучаемых бактерий вносят культуру дрожжей в количестве 15–20 клеток на 1 мл среды. Учет размножения дрожжей производят через 24 час инкубации в счетной камере Горяева или Тома. Для количественного определения используют никотиновую кислоту в разведении 0,5 мкг/мл. Индикатором на пантотеновую кислоту служит Saccharomyces cereviseae штамм ленинградский. Опыт ставят на среде Ридера, на 1 л которой добавляют инозит – 5 мг, витамин B1 – 1 мг, никотиновую кислоту – 0,25 мг, пиридоксин – 0,25 мг, биотин – 0,004 мкг. Учет размножения дрожжей проводят через 48 час. Для количественного определения используют пантотеновую кислоту в разведении 0,15 мкг/мл. Определение рибофлавина (витамин В2) проводят при помощи микроорганизма-индикатора Actinomyces rimosus штамм 58. Актиномицет предварительно выращивают на кукурузной среде (кукурузный экстракт: сухого вещества – 5 г, крахмала – 15 г, (NH4)2SO4 – 4 г, К2НРO4 – 2 г, СаСO3 – 3 г, агар-агара – 20 г, воды – 1 л, рН6,8–7,0). Среду Чапека определенного состава (NaNO3 – 2 г, К2НРO4 – 1 г, КСl – 0,5 г, MgSO4 – 0,5 г, FeSO4 – 0,01 мг, глюкозы – 20 г, агар- агара – 20 г, дистиллированной воды – 1 л, рН6,8–7,0) разливают тонким слоем в чашки Петри, затем застывший агар засевают суспензией спор A. rimosus. Кроме того, на поверхности агара размещают металлические цилиндрики одинакового размера – 6 шт. В каждый цилиндрик вносят по 0,1 мл раствора исследуемой культуры. После культивирования в течение трех суток в термостате при 37° С измеряют диаметр зон роста. |