Серологический метод основан на взаимодействии антитела с антигеном, которое может выражаться то в виде склеивания бактериальных тел в реакции агглютинации, то в виде выпадения осадка–преципитата в реакции преципитации и т. п.
В изучении бактериальных болезней растений серологический метод, как показывает история исследований, применялся главным образом для серодиагностики фитопатогенных бактерий. Поэтому в настоящей главе мы остановимся на описании различных методик указанного метода.
Серодиагностика фитопатогенных бактерий охватывает описание постановки ряда иммунобиологических реакций: агглютинации, кольцепреципитации, насыщения по Кастелляни, связывание комплемента, преципитации в геле, применения флюоресцирующих сывороток и др.
Агглютинация
Агглютинацией называется явление склеивания микробов и выпадение их в виде хлопьев при воздействии агглютинирующей сыворотки. Для получения иммунных сывороток, необходимых для постановки этой реакции, применяется метод внутривенного введения возбудителя бактериоза. Для этой цели используют краевые ушные вены кролика. Такую вену очищают от пуха, протирают спиртом и зажимают ее пальцем у корня уха, что вызывает ее набухание. Когда игла шприца введена в вену, помощник перестает прижимать ее, и вводимая жидкость легко входит. Затем иглу выводят из вены, а к месту укола прижимают ватку со спиртом.
Для внутривенного введения следует пользоваться тонкими иглами, сильно наклоняя шприц, чтобы игла была почти параллельна вене.
Инструменты и материал для введения животным должны быть строго стерильными. Шприцы и иглы кипятят в течение 5–10 мин в дистиллированной воде. При этом шприц должен быть разобран, а в иглу вставлена нержавеющая проволочка (мандрен). Иглы можно стерилизовать и сухим жаром, помещая их острием вниз в маленькие пробирки, на дне которых имеется клочок ваты. Пробирку закрывают ватной пробкой и стерилизуют как посуду.
Перед началом работы собирают шприц, надевают иглу и набирают бактериальной взвеси немного больше, чем надо, затем переворачивают шприц вверх иглой, накрывают его кусочком ваты, смоченным в спирте, выталкивают из шприца пузырьки воздуха и только после этого вводят бактериальную суспензию в ухо кролику (рис. 51). После окончания работы шприц и иглы кипятят, затем хорошо промывают в воде, а потом в спирте и высушивают в термостате.

Приводим методику получения иммунных агглютинирующих сывороток, применяющуюся в отделе фитопатогенных бактерий Института микробиологии и вирусологии АН УССР. Как правило, эта методика дает возможность получать высококачественные иммунные сыворотки, хорошо сохраняющие свои свойства в течение длительного периода времени.
Иммунизация кроликов по этой методике производится по следующей схеме:

Для инъекций используют обычно живую однодневную культуру возбудителя бактериоза, которую смывают физиологическим раствором с агарового косяка и доводят по оптическому стандарту до нужного количества микробных клеток в 1 мл суспензии.
После окончания иммунизации перед взятием крови ставят пробную или ориентировочную реакцию агглютинации на предметном стекле. Делают это таким образом: на поверхность стекла наносят каплю сыворотки в разведении 1 : 10–1 : 50 и рядом контрольную каплю стерильного физиологического раствора. Затем прокаленной петлей набирают комочек бактериальной колонии и вносят его в каплю физиологического раствора и в каплю сыворотки, растирая до получения равномерной взвеси. Результаты просматривают через 5–10 мин. При положительной: реакции в капле сыворотки образуются хлопья, заметные и для невооруженного глаза. Эти хлопья особенно хорошо видны в том случае, если под стекло положить черную фотографическую бумагу.
Пробную реакцию агглютинации следует ставить и для определения полученного титра сыворотки. Если оказывалось, что титр был недостаточным, то делают дополнительные инъекции в брюшину кролика через две-три недели после последнего введения три раза: два раза по 1,5 млрд. и один раз 2 млрд. микробных клеток.
Как правило, после окончания иммунизации кровь берут на 13-й день из сердца кролика, разливая ее небольшими порциями в стерильные, промытые дистиллированной водой (чтобы избежать приклеивания крови) пробирки, которые затем помещают в термостат при 37° С для свертывания.
Через 2 час пробирки вынимают, освобождают сгусток, который образовался, и выносят на холод для отстаивания сыворотки. На следующий день сыворотку отсасывают стерильными пипетками в чистые стерильные пробирки, консервируют небольшим количеством тимола (один-два кристаллика на пробирку) и запаивают. В таком состоянии сыворотка может сохраняться сравнительно долго, почти не теряя своего титра.
Кровь можно брать также из уха. Для этого кожу уха кролика очищают от шерсти, краевую вену для ее расширения смазывают ксилолом, вытирают ватой, смоченной физиологическим раствором и делают поперечный разрез кожи и вены лезвием безопасной бритвы. Стекающую кровь собирают в широкую пробирку в количестве 40–60 мл, затем подкожно вводят кролику физиологический раствор в объеме взятой крови. В дальнейшем с кровью поступают так, как это делают с кровью, взятой из сердца.
Существует несколько методов постановки реакции агглютинации: макроскопическая в пробирках; микроскопическая в раздавленной или висячей капле на предметном стекле и ускоренная по методу Нобля с применением концентрированных агглютинирующих сывороток.
Для постановки макроскопической реакции агглютинации в пробирках необходимо иметь: агглютинирующую сыворотку, агаровую культуру бактерий, физиологический раствор, градуированные на 1 и 10 мл пипетки с делениями на десятые доли миллиметра, пастеровские пипетки и набор чистых пробирок в штативе.
Для проведения этой реакции готовят прежде всего разведение сыворотки 1 : 50. Для этого в пробирку, содержащую 4,9 мл физиологического раствора, вносят 0,1 мл сыворотки. Затем расставляют в штатив сухие чистые пробирки одинакового диаметра, на которых надписывают степень разведения сыворотки: 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400, 1 : 800, 1 : 1600, 1 : 3200, 1 : 6400, 1 : 12 800, 1 : 25600 и 1 : 51200. К этим пробиркам добавляют еще одну, которая служит контрольной. Во все пробирки кроме первой разливают по 0,5 мл физиологического раствора. Затем вносят в первую и вторую пробирки по 0,5 мл из основного разведения сыворотки 1 : 50, после чего приступают к титрованию сыворотки, т. е. из второй пробирки после тщательного смешивания внесенных в нее жидкостей переносят 0,5 мл в третью пробирку, тщательно перемешивают, затем из третьей пробирки переносят 0,5 мл жидкости в четвертую и т. д. до предпоследней пробирки, из которой после перемешивания 0,5 мл выливают. В последнюю пробирку сыворотку не вносят, так как она является контрольной. В ней имеется только физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляют одной и, той же пипеткой по 0,1 мл микробной взвеси, приготовленной на физиологическом растворе. Пробирки тщательно взбалтывают, помещают в штатив, который ставят в термостат на 2 час при 37° С. По истечении этого времени штатив с пробирками вынимают из термостата, отмечают предварительные результаты реакции агглютинации и оставляют на сутки при комнатной температуре. На следующий день отмечают окончательные результаты реакции агглютинации. Просмотр результатов агглютинации, используя агглютиноскоп (рис. 52) или зеркало от микроскопа, начинают с контрольной пробирки, жидкость в которой после встряхивания должна быть равномерно мутной.

Затем просматривают все остальные пробирки, отмечая наличие агглютинации и ее интенсивность, обычно обозначаемую количеством соответствующих крестов. Например:
(++++) – полное просветление жидкости; бактерии, осевшие на дно, образовали своеобразный зонтик;
(+++) – имеется такая же картина, но наблюдается слабая опалесценция, создаваемая небольшим количеством бактерий, не осевших на дно;
(++) – бактерии осели на дно примерно на 50%; в мутной жидкости плавают бактерии, которые не склеились;
(+) – очень небольшой осадок на дне; в жидкости наблюдается незначительное количество бактерий, которые склеились;
(–) – отсутствие реакции агглютинации; муть такая же, как и в контроле.
По характеру склеивания бактерий антителами сыворотки агглютинация бывает крупнохлопьевидной и мелкозернистой. Крупнохлопьевидная агглютинация характеризуется образованием рыхлого осадка, оседающего на дно в виде белого, как бы кружевного зонтика (рис. 53). Жидкость над ним бывает совершенно прозрачной.

При встряхивании со дна пробирки всплывают крупные хлопья. Мелкозернистый агглютинат дает плотный осадок на дне пробирки, подымающийся при встряхивании мелкими зернами. В контрольной пробирке агглютинации не бывает, при встряхивании появляется равномерная муть.
Такая же муть наблюдается и в тех пробирках, где агглютинации не произошло.
При наличии агглютинации в контроле реакция считается неудачной. Необходимо повторное исследование.
Для проведения микроскопической реакции агглютинации надо иметь чистые покровные стекла и предметные стекла с углублением. На покровное стекло наносят каплю сыворотки в разведении 1 : 100–1 : 500 и каплю физиологического раствора. В каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной взвеси для образования еле заметной мути. Предметное стекло по краям углубления смазывают тонким слоем стерильного вазелина и накладывают углублением вниз на покровное стекло таким образом, чтобы капля оказалась на середине углубления. Покровное стекло при этом приклеивается к предметному. Затем стекло быстро переворачивают таким образом, что капли оказываются висячими над углублениями предметного стекла. Через 15–30 мин их рассматривают под микроскопом при сухой системе (окуляр х10, объектив х40).
При положительной реакции агглютинации в капле сыворотки наблюдается постепенное замедление подвижности бактерий, склеивание их в конгломерат различного размера, которое становится потом заметным и невооруженным глазом. В контрольной капле видны равномерная взвесь бактерий и их движение. Микроскопическую реакцию агглютинации можно наблюдать и в раздавленной капле на предметном стекле, покрытом покровным стеклом.
Для ускорения получения результатов реакции агглютинации пользуются методом Нобля, применяя высокие концентрации антигена и сыворотки и встряхивание. Для постановки реакции берут густые микробные взвеси, содержащие не менее 3–4 млрд. бактериальных клеток в 1 мл. Сыворотку разводят физиологическим раствором 1 : 10, 1 : 20 и 1 : 40. Отмеряют в агглютинационную пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки и антигена. Смесь энергично встряхивают в течение 5 мин, после чего к ней добавляют 0,8 мл физиологического раствора. Затем проводят учет результатов реакции. В качестве контроля служит антиген в физиологическом растворе. Следует отметить, что исходное разведение сыворотки при смешивании с антигеном увеличивается вдвое. Поэтому реакция в данном случае протекает в разведении сыворотки 1 : 20, 1 : 40 и 1 : 80. Последующее добавление физиологического раствора не изменяет ее разведения, так как его проводят после завершения процесса реакции.
Метод Нобля при употреблении значительных, достигающих предельного титра разведения сыворотки, может давать четкие результаты, совпадающие с результатами обычной агглютинации.
Учет результатов производится при помощи невооруженного глаза, лупы или агглютиноскопа.

---

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Добавить