Новости

Реакция связывания комплемента

03.02.2014

Реакция связывания комплемента заключается в том, что соединение антигена с соответствующим ему антителом извлекает из свежей сыворотки и прочно удерживает (связывает) находящийся в ней комплемент. Применяется для обнаружения антител и определения природы антигенов. При отсутствии специфического сродства между антигеном и сывороткой адсорбция комплемента не происходит.
Для проведения этой реакции необходимы следующие ингредиенты:
- 3 или 5%-ная взвесь эритроцитов барана;
- гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
- комплемент в дозе, установленной титрованием; антиген, не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни его задержки, в дозе, установленной титрованием;
- испытуемая сыворотка, активированная при 56°С в течение 15–30 мин в водяной бане и разведенная 1 : 5 или 1 : 10; стерильный физиологический раствор (0,85%).
Эритроциты барана. Эритроциты барана получают накануне постановки реакции пункцией яремной вены у барана в асептических условиях при помощи канюли. Кровь собирают в стерильную банку, содержащую стеклянные бусы, которые встряхивают для дефибринирования в течение 10–15 мин. После этого кровь фильтруют через несколько слоев марли и производят трехкратное отмывание эритроцитов в физиологическом растворе на центрифуге. Последняя порция промывной жидкости должна быть бесцветной.
Для постановки реакции применяется 1–3%-ная взвесь эритроцитов, которая готовится из 1 мл осадка отмытых эритроцитов + 33 мл физиологического раствора. В холодильнике эритроциты могут сохраняться пять-шесть дней. Для более длительного хранения их отмывают в жидкости Рингер-Локка следующего состава: NaCl – 9,0 г, КСl – 0,2 г, СаСl2 – 0,2 г, NaHСО3 – 1,0 г на 1 л дистиллированной воды. Жидкость стерилизуют паром в течение 30 мин, а затем добавляют 10 г кристаллической борной кислоты. На леднике эта жидкость может храниться две-три недели.
Консервировать эритроциты можно также и формалином, добавляя к 10 мл осадка эритроцитов 1 мл раствора формалина такого состава: 4 мл 40%-ного формалина на 200 мл физиологического раствора.
Гемолитическая сыворотка. Для получения гемолитической сыворотки кроликам внутривенно вводят три-четыре раза 50%-ную взвесь бараньих эритроцитов по 2–5 млн. с интервалами в два-три дня. На шестой-седьмой день после окончания иммунизации проверяют титр сыворотки. Если он не ниже 1 : 1200, у животного берут кровь из сердца или из краевой вены уха. После инактивации на водяной бане при 55° С в течение 30 мин сыворотку консервируют с добавлением к ней 1 % сухой борной кислоты. Для консервирования сыворотки можно применять равный объем стерильного глицерина, прогретого при 180° С в течение 15 мин или добавлять 1 мл смеси на 9 мл сыворотки такого состава – карболовой кислоты 5,5 мл + глицерина 20 мл +74,5 мл дистиллированной воды. Можно использовать также 0,05%-ный хинозол. Сыворотку надо хранить в запаянных пробирках на леднике.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме.

Реакция связывания комплемента

В ряд пробирок последовательно отмеряют по 0,5 мл полученных разведений, начиная с 1 : 1000. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов, 0,5 мл разведенного 1 : 10 комплемента и 1 мл физиологического раствора. Отмеривать разведения сыворотки надо градуированной пипеткой, начиная с последней пробирки, содержащей минимальное разведение сыворотки, чтобы не нарушить точности разведений.
Ниже приводим схему титрования гемолитической сыворотки.
Реакция связывания комплемента

Титром гемолитической сыворотки называется ее максимальное разведение, 0,5 мл которого может растворить 0,5 мл взвеси эритроцитов при наличии 0,5 мл (разведенного) комплемента в течение 1 час при соответствующей температуре.
Гемолитическую сыворотку (гемолизин, гемолитический амбоцептор по Эрлиху) можно приобрести в соответствующих снабжающих организациях. Она отпускается в ампулах, содержащих 1–2 мл и бывает годной к употреблению в течение шести месяцев. На ампулах указан титр, т. е. предельное разведение сыворотки, которая, будучи смешана с равным объемом (по 0,5 мл) 10%-ного комплемента, полностью гемолизирует 0,5 мл взвеси бараньих эритроцитов после 1-часового стояния в термостате. Титр сыворотки время от времени необходимо проверять. Для постановки основного опыта, а также для титрования антигена и комплемента применяют разведение, которое в три раза меньше титра. Например, если титр равен 1 : 1200, берут разведение 1 : 400 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 40 мл физиологического раствора).
После вскрытия ампулы оставшуюся сыворотку переливают в сухую стерильную пробирку и хранят на холоду.
Комплемент. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотках млекопитающих животных и особенно в сыворотке морской свинки. Вот почему в качестве комплемента и применяется активная сыворотка морских свинок.
Сыворотку получают при помощи пункции сердца у трехпяти здоровых небеременных и не подвергавшихся обработке человеческим белком морских свинок, смешивая отдельные порции вместе. После образования сгустка фибрина последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в ледник. На следующий день отсасывают прозрачную сыворотку, которая называется комплементом. Для реакции необходимо употреблять только тот комплемент, который получен накануне, так как активность его сохраняется на леднике один-два дня. Комплемент можно консервировать добавлением 4%-ной борной кислоты и 5%-ного сернокислого натрия в сухом виде. После растворения указанных веществ комплемент помещают на ледник. Перед каждым выполнением опыта производится титрование комплемента для определения так называемой рабочей дозы. Приготовляют при помощи градуированной пипетки основное разведение комплемента 1 : 10 (1 мл комплемента + 9 мл физиологического раствора), которое разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл, после чего доводят объем каждой пробирки физиологическим раствором до 1,5 мл, помещая их затем в термостат. Через 15 мин к 3%-ной взвеси бараньих эритроцитов прибавляют равный объем гемолизина, взятого в тройном титре. После трехкратного переливания из одного сосуда в другой полученную смесь выдерживают еще 30 мин в термостате. После этого во все пробирки с разведениями комплемента добавляют по 1 мл гемолитической смеси, тщательно встряхивают и снова помещают в термостат на 30 мин. В качестве двух контролей применяют: 1 мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл комплемента, разведенного 1 : 10 + + 0,5 мл взвеси эритроцитов +1,5 мл физиологического раствора.
Титром комплемента называется то минимальное его количество, при наличии которого 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре способно лизировать 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов в течение 30 мин при 37° С.
Реакция связывания комплемента

В связи с антагонистическим влиянием на комплемент других ингредиентов (антиген, гемолитическая сыворотка), участвующих в реакции, практически дозу комплемента надо увеличить на 20–35%, представляющую собой так называемую рабочую дозу. Так, при титре 0,25 рабочая доза будет составлять 0,3–0,33. Однако, при употреблении антигенов с заведомо антикомплементарной способностью необходимо определить рабочую дозу комплемента при наличии антигена по следующей схеме.
Реакция связывания комплемента

Если же антиген не обладает антикомплементарными свойствами, то рабочая доза комплемента остается той, которая была определена титрованием комплемента per se.
Пункции сердца у одной и той же свинки можно повторять много раз с промежутками три-четыре недели.
Антиген. Антиген готовят из бактериальной культуры. Наиболее простым антигеном является взвесь в дистиллированной воде или физиологическом растворе микробов, убитых нагреванием при 60° С в течение 1 час или при 100° С в течение 15– 20 мин.
В качестве антигена может применяться также микробная взвесь, убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для получения антигена, обработанного алкоголем, поступают таким образом: взвесь 24-часовой агаровой культуры, предварительно промытую физиологическим раствором, центрифугируют. Жидкость декантируют, а осадок заливают 95°-ным спиртом в соотношении 1 : 5, после чего оставляют на два-три дня при комнатной температуре. После удаления алкоголя осадок микробов заливают физиологическим раствором и консервируют добавлением 1%-ной сухой борной кислоты. Для реакции исходную взвесь разводят по оптическому стандарту, содержащему 1 млрд. бактериальных тел в 1 мл, употребляя ее в количестве 0,5 мл в качестве антигена.
Микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате или после обработки антиформином, также могут служить антигеном.
Для получения антигена при обработке культуры антиформином необходимо к суточной агаровой культуре бактерий, смытой 1,5 мл физиологического раствора, добавить 2 мл 3–4%-ного антиформина, нейтрализованного по лакмусу с добавлением 4%-ной H2SO4. Хлор удаляют нагреванием лизата на водяной бане при 55–65° С в течение 30 мин под контролем йод-крахмальной бумажки, приобретающей под влиянием хлора чернофиолетовое окрашивание.
Диализированный бактериальный полисахарид, а также полный антиген, полученный по методу Буавена, обладают высокими антигенными качествами.
У антигенов, полученных различными методами, определяют титр, а также антагонистические свойства в отношении активности комплемента (антикомплементарность) и гемотоксичность – способности вызывать лизис эритроцитов в отсутствии сыворотки и комплемента.
Титром антигена называют его количество в 1 мл при общем: объеме реакции в 2,5 мл, при которой происходит отчетливый гемолиз. Антиген берут в количестве 0,5 мл. Для определения рабочей дозы в ряд пробирок отмеривают антиген в количестве от 0,1; 0,2 и т.д. до 0,5 мл, к которым добавляют физиологический раствор до 1 мл. Затем прибавляют по 0,5 мл разведения комплемента, содержащего рабочую дозу и 0,5 мл физиологического раствора, встряхивают и помещают на 1 час в термостат. После этого вынимают из термостата и отмечают пробирку с максимальным содержанием антигена, в которой наблюдается еще гемолиз. Количество антигена в этой пробирке является показателем растворяющей дозы антигена. Ориентировочная доза антигена, необходимая для дальнейшего испытания, составляет 1/2 или 2/3 растворяющей дозы. Для определения специфичности ее испытывают затем с заведомо положительными и отрицательными сыворотками. При успешном титровании антигена такого рода найденную дозу принимают за его титр, которым и пользуются для постановки реакции. Схема определения ориентировочной дозы антигена следующая.
Реакция связывания комплемента

Антикомплементарность устанавливают путем параллельных фильтрований комплемента per se при наличии антигена, который не должен подавлять активность комплемента больше чем на 30%, в противном случае он не годится для реакции.
Для определения гемотоксичности к 1 мл антигена, разведенного по титру, добавляют 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов и 1 мл физиологического раствора и помещают на 1 час в термостат. Отсутствие гемолиза указывает на отсутствие гемотоксических свойств антигена. Следует отметить, что все антигены бактериального происхождения (взвеси, лизаты, экстракты) перед опытом обязательно подвергаются титрованию, за исключением бактериального алкогольного антигена, который вообще способен долгое время сохранять свой титр. Кроме того, бактериальная взвесь определенной концентрации (например, 1 млрд. клеток в 1 мл по оптическому стандарту) также исключает необходимость титрования, так как 0,5 мл такой взвеси лишена антикомплементарных и гемотоксических свойств. Сохранять антигены следует на леднике.
Сыворотки. Для определения неизвестного антигена применяется специфическая иммунная сыворотка, полученная путем иммунизации кроликов и обладающая большей частью высоким титром. Полученная сыворотка инактивируется в водяной бане при 55–56° С в течение 30 мин. Инактивирование проводится с целью стабилизации коллоидов сыворотки. Такая сыворотка может сохраняться в леднике пять-шесть дней. Срок хранения ее увеличивается до двух-трех недель, если к инактивированной сыворотке добавить 2% сухой борной кислоты или смеси из 4% сухой борной кислоты и 5% кристаллического сернокислого натрия. Сыворотки хранят в запаянных ампулах.
Проведение реакции. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент таким образом, чтобы количество каждого ингредиента равнялось 0,5 мл. После тщательного встряхивания каждой пробирки штатив помещают в термостат на 1 час при 37° С. Через 30 мин после этого готовят гемолитическую систему, т. е. смешивают в равных объемах 3%-ную взвесь эритроцитов барана с разведенной по утроенному титру гемолитической сывороткой. Смесь помещают на 30 мин в термостат. По истечении указанного срока во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, тщательно перемешивают и помещают в термостат на 40–60– 120 мин в зависимости от времени появления гемолиза в контрольных пробирках, не содержащих антигена. Затем производится первое определение результатов опыта, после чего штатив помещают в ледник на 12–18 час или оставляют при комнатной температуре. По истечении этого срока учитывают окончательные результаты опыта.
При наличии полного гемолиза (лаковая кровь) во всех четырех пробирках, взятых для исследования сыворотки, результат считается отрицательным. При положительных результатах в первых трех пробирках наблюдается задержка гемолиза, а в четвертой (контроль сыворотки), не содержащей антигена, – полный гемолиз. Степень задержки гемолиза принято обозначать количеством крестов.
(++++) – полная задержка гемолиза (жидкость бесцветна, значительный осадок неизмененных эритроцитов);
(+++) – ясная задержка (жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов);
(++) – частичная задержка (жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов);
(+) – слабая задержка (жидкость интенсивно окрашена, незначительный осадок эритроцитов);
(±) – следы задержки (жидкость интенсивно окрашена, осадок в виде облачка);
(–) – полный гемолиз (жидкость интенсивно окрашена, отсутствие осадка, отрицательная реакция).
Приводим схему основного опыта.
Реакция связывания комплемента

В литературе имеются указания на многочисленные попытки модифицировать реакцию связывания комплемента, например, модификации Каупа, Калинина и Гинзбурга, применивших метод холодного связывания комплемента. Этот метод повышает чувствительность реакции и обладает большой эффективностью и ставится при температуре 0–4° С.


Имя:*
E-Mail:
Комментарий: