Методы исследования явления бактериофагии

03.02.2014

Бактериофагией называется процесс лизиса бактериальных клеток под влиянием специфического субмикроскопического агента – бактериофага. Фаги поражают большое количество видов микроорганизмов из различных систематических групп и весьма широко распространены в природе. Практически их можно обнаружить во всех местах обитания микроорганизмов. Для получения явления бактериофагии необходимо наличие живой, молодой и развивающейся культуры и активного бактериофага. На мертвые бактерии бактериофаг не действует.
Бактериофаг можно выделять из пораженных им бактерий и из тех объектов, в которых обитает данная бактерия. В литературе описаны различные методы его выделения. Многие из них могут быть использованы и для выделения бактериофагов к фитопатогенным бактериям. Один из таких методов рекомендует А.П. Пехов. Заключается он в следующем. К 30 мл мясопептонного бульона, засеянного 1 мл молодой бульонной культуры бактерий, к которой хотят получить фаг, добавляют 1 мл надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования исследуемого материала. Посев помещают на сутки в термостат при температуре, оптимальной для роста бактерий. После этого надосадочную жидкость центрифугируют, подвергают фильтрации и выявляют фаг путем посева фильтрата, прибавленного к культуре, на мясопептонный бульон или на мясопептонный агар.
Для обнаружения фаговых частиц в фильтрате могут применяться несколько способов.
1. К серийным разведениям фильтрата, начиная с 1 : 10, прибавляют культуру бактерий, а затем делают высевы на агаровые пластинки. Посевы выращивают при оптимальной температуре в течение 18 час. Наличие фага в фильтрате определяют по пятнам или зонам лизиса на агаре.
2. 10 мл мясопептонного бульона засевают 0,05 мл молодой культуры и 0,1 мл фильтрата. Посевы помещают в термостат. В процессе выращивания через каждый час проводят исследования на определение мутности (нефелометрически). Отсутствие или увеличение мутности с последующим ее просветлением свидетельствует о наличии фага.
3. К 2,5 мл растопленного и остуженного до 46° С 0,7%-ного мясопептонного агара прибавляют одну каплю взвеси агаровой культуры бактерий и 1 мл разведенного фильтрата. Смесь выливают в чашки Петри на поверхность приготовленных в них мясопептонных пластинок 1,5%-ного агара. После того как смесь остынет, чашки помещают в термостат. О наличии фага свидетельствуют светлые пятна на фоне сплошного бактериального роста. Этот метод носит название метода агаровых слоев и дает возможность выявить бактериофаг даже в том случае, если он имеется в таком незначительном количестве, что в жидких средах обнаружить его не удается. Для получения фага отбирают на пластинках пятна, снимают их петлей и переносят в 1 мл мясопептонного бульона.