Методы получения и изучения L-форм
03.02.2014
Одной из форм изменчивости бактерий является образование L-форм. Существует мнение, что L-формы фитопатогенных бактерий (Agrobacterium tumefaciens) могут служить причиной возникновения вторичных инфекций. По всей вероятности, L-формы могут явиться также одной из форм сохранения возбудителей бактериозов в природе при неблагоприятных условиях существования. В связи с этим изучение L-форм фитопатогенных бактерий заслуживает определенного внимания.
Методы получения и изучения L-форм бактерий, патогенных для человека и животных, разработаны достаточно хорошо. Использование этих методов дало возможность получить L-формы некоторых видов фитопатогенных бактерий.
L-формы представляют собой шаровидные и нитевидные структуры, в которые превращаются нормальные клетки. При распаде этих структур образуются субмикроскопические формы бактерий, способные проходить через бактерийные фильтры.
Наиболее активными факторами, влияющими на образование L-форм, являются аминокислоты (глицин, карбоксиметаксиламин, dl-метионин, l-фенилаланин и др.), некоторые антибиотики, из которых на первое место следует поставить пенициллин (для туберкулезных бактерий – стрептомицин), бактериофаги, иммунные сыворотки, аминокислоты в комбинации с антибиотиками, высокие концентрации хлористого натрия или фосфатного буфера, высокие концентрации солей в сочетании с пенициллином и др.
Непременным условием для культивирования L-форм у бактерий, патогенных для человека и животных, является наличие в среде 10–20% нормальной лошадиной сыворотки, или асцитической жидкости. Кроме того, питательная среда должна иметь полутвердую (1,0–1,5% агара) или полужидкую (0,1– 0,3% агара) консистенцию, повышенную гипертоничность за счет увеличения концентрации фосфатных солей, NaCl, сернокислой магнезии, сахарозы или других веществ. Сыворотка может быть заменена витаминами группы В, поливинолуролидоном или древесным углем.
Универсальных сред для получения и пассирования L-форм различных видов бактерий не существует. Условия культивирования также являются различными в зависимости от вида бактерий. Однако в качестве основы питательной среды используют выcокопитательные бульоны: настой или перевар сердечной мышцы, триптический гидролизат белков рыбной муки, бульон Готтингера, казеиновый перевар, печеночный бульон. С целью повышения питательности среды в нее добавляют экстракт дрожжей. Для получения L-форм бактерий используют также синтетические среды, в которых различные комбинации неорганических солей и органических соединений сочетаются с наборами аминокислот. В монографии В.Д. Тимакова и Г.Я. Кагана (1961) приведен состав нескольких сред для получения L-форм из исходных культур и для их культивирования в течение нескольких генераций.
На полутвердых и полужидких средах L-формы развиваются в виде пенистых слизистой консистенции колоний. Края таких колоний нежные, прозрачные, как бы кружевные. Центр суховат, уплотнен, слегка пигментирован, врастает в глубь среды. Иногда наблюдается образование желто-коричневого пигмента. Описана «мутация» L-форм в виде «бесцентровых» колоний, не врастающих в толщу среды. Колонии по внешнему виду одинаковы у разных, даже весьма отдаленных видов бактерий. Размеры колоний варьируют от 0,1–0,5 до 2–3 мм. Различают два типа колоний L-форм у некоторых видов – 3В и 3А. Колонии 3В являются промежуточной фазой L-трансформации, они больше размером, чем колонии 3А, со временем приобретают желтокоричневую окраску, легко превращаются в исходную форму. Колонии 3А являются как бы завершающей фазой L-трансформации. Они главным образом формируют культуры стабилизированных L-форм, не реверсируют в бактериальные формы исходного вида.
Колонии L-форм A. tumefaciens, полученные путем 50-кратного пассирования на глюкозной среде с 4% глицина, были округлые, студенистые, прозрачные, без обычного темного центра. Микроскопически они состояли из сферических элементов диаметром до 0,8 мк.
Методы посева и выращивания, изучение морфологических, серологических и других свойств L-форм также имеют свои особенности.
Наиболее распространенным методом посева бактерий для получения L-форм является метод Динеса (1951), согласно которому бактериальную взвесь (~2 млрд/мл) в объеме 0,1 мл распределяют по поверхности чашки, не применяя втирания шпаделем. В центре такой засеянной бактериями чашки делают углубление, в которое вносят пенициллин в высоких концентрациях. Через 24 час рост бактерий в зоне 2–3 см вокруг углубления с пенициллином угнетается, нормальные бактериальные тела превращаются в гигантские формы, волокнистые образования, из которых затем формируются L-формы; дальше начинается обычный рост бактериальной культуры. Хорошие результаты получаются при посеве относительно больших объемов культуры в пробирки с питательной средой (1 : 20) и последующем переносе питательной среды в чашки Петри.
Выращивать L-формы бактерий можно на целлофановой мембране по методу Маттман и Фаркаш (1958). Имеется также ряд специальных методов для изучения морфологии колоний и структурных образований L-форм, поскольку обычные методы микроскопического исследования фиксированных и окрашенных препаратов мало пригодны для их изучения.
Для исследования поверхностного строения колоний L-форм Эрстов (1927, 1942) предложил проводить микроскопирование колоний непосредственно в агаре. Динес (1943, 1951) предложил метод окрашивания колоний метиленовой синью или лазурью с последующей микроскопией непосредственно в агаре или в агаровом блоке.
Прижизненная окраска L-форм по Динесу. Несколько капель 0,5%-ного алкогольного раствора метиленовой синьки наносят на покровное стекло. Затем краску осторожно выпаривают на пламени горелки. После высыхания на стекло наносят одну петлю 0,5%-ного раствора фосфорной кислоты и слегка высушивают. Предварительно окрашенное покровное стекло осторожно, без скользящего движения кладут на кусочек агара с испытуемой колонией, вырезанный из слоя агара и помещенный на предметное стекло колонией вверх. Края покровного стекла парафинируют.
Метод Динеса, модифицированный Тюланом (1951). Вырезанный кусочек агара или желатины помещают колонией вверх на предметное стекло и покрывают покровным стеклом, на поверхности которого дают высохнуть смеси следующего состава:
Препарат парафинируют.
Метод отпечатков по Клинебергер (1950) – агаровый блок помещают на покровном стекле колонией вниз и по каплям наносят раствор Буэна для фиксации. Приготовленный таким образом блок помещают во влажную камеру на 8–24 час (до побеления агарового блока). Затем агар при помощи насоса снимают с покровного стекла, на котором остается зафиксированный отпечаток колонии. Дважды промытый в течение 10 мин препарат окрашивают раствором краски Гимза-Романовского (100 мл равных частей дистиллированной и водопроводной воды и 3,5 мл краски Гимза) в течение 24 час.
Изучение динамики образования L-форм, особенности их размножения и процесса реверсии в бактериальные клетки возможно только путем прижизненного наблюдения в специальных микрокамерах при помощи фазовоконтрастного микроскопа, а также при использовании метода серийной микрофотосъемки или цейтрафферной микрофотосъемки. Для изучения тонкого строения отдельных микроструктур L-форм применяется электронная микроскопия.
Изучение в электронном микроскопе L-форм A. tumefaciens показало наличие у них капсулы, клеточной оболочки, цитоплазматической мембраны и плохо проницаемой для электролитов цитоплазмы. L-формы A. tumefaciens используют те же сахара, что и исходная, обладают способностью вызывать корончатые галлы. Рубио-Хуэртос (1957) полагает, что в возникновении вторичных опухолей растений основную роль играют L-формы возбудителя.
