Новости

Выявление фильтрующихся форм фитопатогенных бактерий

03.02.2014

Возникновение фильтрующихся форм в культурах на искусственных питательных средах, в объектах внешней среды, в организме человека и животных может быть обнаружено лишь косвенно путем последующего их развития в клеточные, вегетативные формы.
Методам выявления фильтрующихся форм бактерий, патогенных для человека и животных, посвящено огромное количество исследований. Детально изучены способы получения фильтрующихся форм и. условия их регенерации в бактерийные клетки. Поскольку жизнедеятельность фитопатогенных бактерий подчиняется общебиологическим закономерностям, многие методы исследований могут быть позаимствованы из медицинской микробиологии. При изучении вопроса возникновения фильтрующихся форм у фитопатогенных бактерий авторы исследований пользовались методами, имеющимися в медицинской практике. Для получения фильтрующихся форм возбудителей бактериозов озимого рапса пользуются методом выделения из старых культур, а для получения вторичных культур бактерий – широко применяемым в медицине методом «кормилок», предложенным в 1932 г. В.В. Сукневым и Г.А. Вольферц.
Основными этапами исследований при выявлении фильтрующихся форм бактерий является создание условий для их образования, отделение их от имеющихся в культуре клеточных форм и получение вторичных культур из фильтрующихся форм.
Метод обнаружения фильтрующихся форм заключается в следующем. Исследуемые бактерии выращивают на скошенном 2%-ном картофельном агаре. В пробирки с суточной культурой выросших бактерий наливают по 5 мл стерильной водопроводной воды. Полученной суспензией пользуются для засева двух матрацев (по 2 мл суспензии на один матрац) с картофельным агаром, которые выдерживают при 25°С двое суток. Выросшую бактериальную культуру смывают с каждого матраца 12 мл стерильной водопроводной воды. Полученную суспензию разливают в отдельные пробирки и оставляют в термостате при 25°С на 10–12 дней с целью получения детрита. В течение этого периода проверяют чистоту культур посевом в чашки Петри с картофельным агаром. Предполагается, что в полученном детрите содержатся фильтрующиеся формы бактерий.
В дальнейшем производят фильтрование содержимого пробирок через стерильный фильтр Зейтца с асбестовой пластинкой «СФ». Полученный фильтрат с содержанием в нем фильтрующихся форм сохраняют в стерильных пробирках в течение 30 дней, проверяя стерильность через каждые десять суток.
Вторичные культуры получают на твердой питательной среде – 2%-ном картофельном агаре. С этой целью пользуются методом «кормилок» по Сукневу и Вольферц, а также добавлением к картофельному агару дрожжевого экстракта. Сущность метода кормилок состоит в следующем. Чашки Петри с твердой питательной средой засевают тремя каплями фильтрата и тщательно втирают его на всей поверхности. После 10–15-минутного подсушивания в термостате чашки засевают культурой кормилок. В качестве кормилок могут быть использованы Staphylococcus aureus, Sarcina rosea, S. alba, S. flava и S. aurantiaca. Контролем служат чашки без посева кормилок. Посев кормилок производят в виде пяти колец. Чашки выдерживают в термостате в течение 15–21 дня. С целью предупреждения подсыхания агара в чашках последние на третьи сутки помещают в эксикатор с ватой на дне, увлажненной дистиллированной водой. В начале наблюдается только рост кормилок. На шестые-седьмые сутки появляются видимые невооруженным глазом очень мелкие колонии, расположенные вблизи сарцин или внутри кольца.
Посев сарцин можно проводить и в виде перекрещивающихся штрихов. На шестой день после посева фильтратов (при 25° С) вокруг мазков сарцины обнаруживаются мелкие колонии, содержащие коккообразные формы бактерий. По своим культурным, морфологическим, биохимическим свойствам они сильно отличаются от исходной культуры. В связи с этим производили посев фильтратов и коккообразных форм бактерий на кусочки ткани растения-хозяина с соблюдением всех правил стерильности. Отобранные для этой цели здоровые образцы растений двукратно обжигали и разрезали на отдельные кусочки. Затем каждый из них снова обжигали и помещали в стерильную пробирку с последующим нанесением на них фильтрата или коккообразных форм бактерий.
Посев фильтрата на ткани растения способствовал образованию коккообразных форм бактерий как и при использовании кормилок. При этом наблюдалось восстановление свойств исходных штаммов возбудителя.
Фильтрующиеся формы A. tumefaciens были обнаружены в перевиваемых опухолях растений.
Эти формы получил также В.Ф. Пересыпкин (1957) у возбудителей бактериозов озимого рапса – X. саmpestris, P. fluorescens var. napi.
Ранее считалось, что фильтрующиеся формы бактерий скорее всего образуются в старых культурах. В настоящее время имеется много исследований, свидетельствующих об обнаружении их в молодых культурах, особенно при аэрировании. Они могут быть обнаружены на всех этапах развития бактерийной популяции, но относительно чаще в лаг-фазе.
Форсирование образования фильтрующихся форм можно достигнуть путем механического нарушения целостности микробных клеток (растирание бактериальных клеток с кварцевым песком или стеклянной ватой), продолжительного встряхивания, при воздействии на культуру ультразвуком, путем «мацерации» клеток в дистиллированной воде, при культивировании в гипертоническом растворе сахарозы, путем многократного замораживания и оттаивания.
Химические вещества, неблагоприятно действующие на бактериальные клетки, также способствуют ускорению образования фильтрующихся форм. С этой целью применительно к объектам медицинской микробиологии были использованы следующие вещества: хлористый литий, панкреатин, фенол, соли кальция, азотнокислое серебро, карбоксиламин, глицерин, азотнокислый калий, хлористый натрий в повышенных концентрациях и др. Наиболее мощным фактором, вызывающим образование фильтрующихся форм, является бактериофаг. Лизис клеток с образованием фильтрующихся форм может возникнуть также под влиянием антибиотиков, фитонцидов, иммунных сывороток.
Наиболее распространенным методом отделения фильтрующихся форм от бактериальных клеток является метод фильтрации. Вместе с тем процедура фильтрации имеет свои недостатки. Так, применение какого-либо фильтра с определенным размером пор ограничивает возможность прохождения более крупных конгломератов, обладающих способностью регенерации в бактериальные клетки. Кроме того, при фильтрации необходимо учитывать возможность забивания пор фильтра, адсорбционные свойства фильтров, их электрический заряд и др.
В связи с этим отделение фильтрующихся форм от клеточных рекомендуют проводить при помощи фракционированного центрифугирования или осторожного прогревания, подобрав предварительно температуру, губительную для клеточных форм данного вида.
С целью отделения фильтрующихся форм от клеточных можно использовать также своеобразный метод, применяемый при изучении L-форм. Сущность последнего заключается в следующем: на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри помещают целлофановую пластинку, на которую затем наносят посевной материал. В результате на поверхности целлофана развиваются колонии клеточных форм, а под целлофаном – вторичные культуры, выросшие из фильтрующихся форм.
Регенерация бактериальных клеток из фильтрующихся форм может быть осуществлена различными путями, подбирая среды и условия для ускорения этого процесса. Однако надо иметь в виду, что ни один из методов не дает стопроцентную высеваемость вторичных культур во всех случаях наличия фильтрующихся форм. Наиболее широко распространенным методом получения вторичных культур является посев материала, содержащего фильтрующиеся формы, на обычные для данного вида микроба жидкие или плотные питательные среды.
Количество используемых сред велико, они очень многообразны в зависимости от вида микроба. Наиболее часто применяются следующие: среда К – мелкодисперсная взвесь белка, полужидкие (коллоидные) среды, среды с различным содержанием сыворотки крови, яичные среды типа среды Безредка как таковой или усложненной, плазма крови, гормональная среда, казеиновый бульон, среды с дрожжевым автолизатом или с факторами роста – никотиновой кислотой или экстрактом виноградных листьев, среды с рибонуклеиновой кислотой или нуклеопротеидом, среда, содержащая гидросульфит натрия, снижающий окислительно-восстановительный потенциал, аденозинтрифосфатную и пировиноградную кислоты.
Недостаток описанного выше метода кормилок Сукнева и Вольферц заключается в том, что стимулирующие свойства кормилок – сарцин или стафилококков – часто утрачиваются в результате длительного хранения или других неблагоприятных условий. Рекомендуется в качестве кормилок вместо сарцин или стафилококков использовать дрожжи, обладающие способностью стимулировать развитие вторичных культур некоторых бактерий.
Принято считать, что образование вторичных культур наиболее успешно осуществляется при пассаже фильтрующихся форм патогенного микроба через восприимчивый к этому заболеванию микроорганизм.
При постановке исследований по выявлению вторичных культур необходимо применять различные методы исследований, повторять исследование одного и того же фильтрата при большой повторности данного опыта.


Имя:*
E-Mail:
Комментарий: