В последнее время для сохранения различных культур бактерий широкое распространение получил метод лиофилизации. Он может применяться как с предварительным замораживанием, так и без него. Высушивание под вакуумом замороженных бактерий позволяет получить обезвоженные клетки без нарушения структуры белковых молекул. При лиофилизации бактерий содержащаяся в них свободная вода замораживается и удаляется путем сублимации льда, т. е. путем превращения его в пар, минуя жидкую фазу.
Конструкция аппаратов для замораживания – высушивания, а также способы его осуществления очень разнообразны.
Для предварительного замораживания в качестве источников холода используют сухой лед, жидкий воздух, азот или кислород. При лиофилизации больших количеств применяется охлаждение в холодильных камерах или в специальных ваннах со спиртом, охлаждаемых холодильной машиной. Если обычные источники холода отсутствуют, для охлаждения можно пользоваться смесью измельченного льда или снега с поваренной солью либо другими смесями, позволяющими получить более низкие температуры.
Подлежащие лиофилизации бактерии выращивают на твердой питательной среде при оптимальной температуре в течение 24 час. Затем бактериальную массу смывают одной из наиболее подходящих защитных сред, разливают в ампулы по 0,2–0,5 мл и замораживают, после чего высушивают в вакуумном аппарате при давлении порядка 20–40 мк.
Лиофильную сушку бактерий можно проводить также без предварительного замораживания при помощи указанных выше способов. В литературе описано несколько способов лиофилизации бактерий непосредственно в вакууме путем самозамораживания, высушивание культур в заранее лиофилизированной защитной среде или на полосках фильтровальной бумаги. Длительность высушивания при этом значительно сокращается.
По окончании лиофилизации ампулы запаивают в пламени двухрожковых газовых горелок, присоединенных к находящемуся под вакуумом коллектору. Для лиофилизации применяют специальные ампулы, имеющие стебли правильной цилиндрической формы. Для получения ампул их стебли не оттягивают из корпуса ампул, а нарезают из трубки диаметром меньшим, чем корпус, и припаивают к нему.
В Англии вместе со специальной аппаратурой для первичного и вторичного высушивания имеется механический растягиватель ампул, который, сохраняя равномерность толщины стенок ампул в месте их запаивания, предупреждает последующее растрескивание стекла.
Бактериальные культуры можно лиофилизировать также непосредственно в средах выращивания, однако основным способом сохранения культур бактерий является лиофилизация их в различных, специально изготовленных для этой цели защитных средах.
В качестве защитных сред применяются вещества, образующие с водой истинные и коллоидные растворы. Эти среды могут быть разделены на три группы: коллоидные среды животного, растительного и минерального происхождения; среды, содержащие растворимые вещества, такие как углеводы и продукты гидролиза белков – пептоны и аминокислоты и среды сложного состава, в которых коллоидные вещества сочетаются с растворимыми. В настоящее время большинство исследователей отдают предпочтение средам, в которых коллоиды сочетаются с растворимыми веществами.
Для лиофилизации различных видов и родов бактерий в Советском Союзе и за границей наиболее часто используют следующие среды.
1. Кровь, плазма, сыворотка и отдельные фракции сывороточных белков.
2. Желатина в виде 5 и 10%-ных растворов. Более эффективна среда Стэмпа, содержащая 10% желатины и 0,25–0,5% аскорбиновой кислоты. Бланков (1960) и Субботина (1960) применили, в качестве коллоида желатину, подвергнутую тепловой обработке и вследствие этого потерявшую способность образовывать гель. Авторы успешно применили для сохранения бактериальных культур среду с 5% желатины и 7,5% сахарозы.
3. Снятое молоко. Коллоиды в снятом обезжиренном молоке естественно сочетаются с углеводами (лактоза). К снятому молоку можно добавить 5% сахарозы и 5% лактозы. Такая среда имеет значительное преимущество перед сахарозо-желатино-агаровой не только при лиофилизации, но и при дальнейшем хранении культур.
4. Растворимые вещества. Хорнибрук (1955) разработал синтетическую защитную среду из растворимых веществ, близкую по составу к диализату молока. Лактозо-солевая среда (pH 7,0) Хорнибрука имеет следующий состав:

Из углеводов чаще всего применяют сахарозу, салицин, декстрин, лактозу и др. Углеводы нередко сочетают с другими коллоидами, что является более эффективным, чем применение только углеводов. Из продуктов гидролиза белков применяют растворы пептона (1–10%) и готовые мясопептонные бульоны. В качестве источников аминокислот в защитных средах могут быть использованы любые гидролизаты белковых субстратов. К этой группе сред можно отнести среду (Бланков), содержащую гидролизат молока и сахарозу (ГМС), на которой получены результаты лиофилизации патогенных микробов кишечного тракта. Среда ГМС представляет собой 7,5%-ный раствор сахарозы в гидролизате натурального обезжиренного молока.
Из отдельных аминокислот и их производных находят применение триптофан, глицин, аспарагин, натриевые соли L- и DL-глутаминовой кислоты и др. Особенно часто применяется глутомат натрия от 2 до 5% в сочетании с другими веществами.
Защитные среды следует готовить на дистиллированной воде во избежание увеличения количества электролитов за счет имеющихся в водопроводной воде.
Лиофильная сушка позволяет длительно сохранять жизнеспособность различных микроорганизмов, признаки исходной культуры, ее патогенные и другие свойства, хотя имеются указания об обнаружении в некоторых случаях нарушения ферментативных свойств, размножения, морфологии и антигенной структуры.
Длительность сохранения жизнеспособности лиофилизированных бактерий, по данным некоторых авторов, исчисляется 10–20 годами.
Режим лиофилизации фитопатогенных бактерий, разработанный Е.В. Самосудовой (1965). В качестве защитных сред, дающих удовлетворительные результаты при лиофилизации, используют желатино-сахарозную среду (желатины – 1 % и сахарозы – 10%, снятое молоко или среду Колесова – 3 мл сыворотки, 1 мл МПБ, 2 мл 56%-ной глюкозы и 6 мл бактериального осадка. Последний получают следующим образом: бактериальную культуру суспендируют в физиологическом растворе, нагревают 2–3 мин при 35° С, добавляют 10% 15%-ной желатины с температурой 55° С. Смесь помещают на 3 час в термостат при 28° С, затем выдерживают при комнатной температуре 24 час и оставляют в холодильнике до образования осадка; надосадочную жидкость сливают.
Подготовленную в одной из защитных сред бактериальную суспензию разливают в ампулы по 0,2 или 0,5 мл, замораживают в течение 5–10 мин при – 30° С и помещают в камеру лиофильной установки. В начале высушивания температура –16, –18° С, в конце –21°С. После достижения вакуума 100 мк досушивание продолжают 3–4 час; конечный вакуум 30 мк, длительность высушивания 6–8 час. Процент остаточной влажности должен быть невелик: для X. malvacearum – 0,7–1,0%. P. citriputeale – в пределах 1,5%, а для Е. carotovora – около 2%. Выживаемость бактерий, представителей трех родов Xanthomonas, Pseudomonas и Erwinia, после лиофилизации составляет 56–68%.
Жизнеспособность лиофилизированных культур лучше всего сохраняется в условиях вакуума при –4° С.
Режим лиофилизации и хранения фитопатогенных бактерий, разработанный Р.А. Леллиоттом (1965). Культуры для лиофилизации выращивают на твердых питательных средах, наиболее подходящих для роста определенного вида возбудителя: представителей рода Corynebacterium – на 2%-ном глюкозном питательном агаре, рода Xanthomonas – на дрожжевом глюкозно-меловом агаре; рода Erwinia и большинства видов рода Pseudomonas – на питательном агаре «Oxoid СМЗ».
Бактериальные культуры лиофилизируют в виде суспензии в защитной среде, содержащей 7% глюкозы и 7% пептона. Эту среду получают следующим образом: отдельно готовят 14%-ный водный раствор глюкозы и 14%-ный водный раствор пептона, стерилизуют раздельно паром при 121° С в течение 15 мин. Затем растворы смешивают. Бактериальная суспензия должна содержать 10в9–10в10 живых клеток в 1 мл. Высушивание замораживанием клеток проводят по методу Аннера (1956). В каждую ампулу на полоску фильтровальной бумаги размером 0,5х2,0 см помещают по 0,04 мл приготовленной суспензии и закрывают неплотной пробкой из шерстяной ваты; ампулы помещают в вакуумный аппарат, содержащий Р2О5, и при помощи двуфазного вращательного насоса получают снижение давления до 50 мк. Такое давление поддерживают в течение 5– 8 мин. Затем давление еще больше снижают (до 7 и 20 мк) и поддерживают в течение 20–25 час. После этого ампулы запаивают при этом же давлении и хранят при комнатной температуре. Большое количество видов фитопатогенных бактерий, принадлежащих к родам Xanthomonas, Corynebacterium, Pseudomonas и Erwinia, лиофилизированных по методу Аннера, остаются жизнеспособными в течение пяти лет хранения. Выживаемость культур не зависит от срока их изоляции из растения-хозяина. Не существует также корреляции между выживаемостью бактерий во время хранения и количеством клеток, оставшихся жизнеспособными непосредственно после высушивания замораживанием.
Лиофилизация различных культур рода Pseudomonas, объединенных в группу P. syringae, по методу Гривса (1944) на L5 центрифужно-замораживающей сушилке, способствовала увеличению срока хранения этих бактерий до семи лет. Высушивание этим способом первоначально протекает в течение 4–5 час, затем 16–18 час. Уровень снижения давления для обоих этапов и объем бактериальной суспензии были такими же, как и при использовании метода Аннера.
Определение жизнеспособности культур в ампулах проводят путем восстановления содержимого в 1%-ной пептонной воде с последующим посевом в чашки Петри для подсчета количества выросших колоний, применяя трехкратную повторность нескольких разведений.

---

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Добавить