Метод обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность метода заключается в экстракции ретинола ацетата и α-токоферола ацетата изопропиловым спиртом с последующим анализом содержания витаминов путем жидкостной хроматографии.
Аппаратура: хроматограф жидкостный микроколоночный со спектрофотометрическим детектором (диапазон длин волн 190-360 нм); спектрофотометр со спектральным диапазоном 186-1100 нм; колонка хроматографическая с числом теоретических тарелок не менее 4 тыс.
Подготовка хроматографической колонки. При использовании новой колонки или колонки после длительного перерыва в работе из нее следует удалить воздух и тщательно промыть. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т. е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 0,05 см3/мин, а затем 0,1 см3/мин.
Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
После промывки колонки проводят ее насыщение витаминами А и Е, для чего выполняют 7-10 анализов наиболее концентрированных градуировочных растворов. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между результатами двух последовательных определений к среднему арифметическому не будет превышать 3%.
При правильной эксплуатации колонка рассчитана на 500-600 анализов.
Приготовление растворителя. Для выделения витаминов А и E используют двухкомпонентный экстрагент состава: изопропиловый спирт и дистиллированная вода в объемном соотношении 97:3 (в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 30 см3 дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом). Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой.
Определение активности витамина А в масляном препарате, Навеску препарата массой 0,1±0,002 г растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе вместимостью 50 см3, добавляют спирта до метки и перемешивают. Отбирают 1-2 см3 раствора в колбу вместимостью 50 см3, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против абсолютного спирта.
Концентрацию витамина А (С, г/см3) определяют по формуле

где D — оптическая плотность раствора; V1, V2 — объем спирта для первого и второго разведения, см3; d — плотность препарата, г/см3; m — масса навески, г; V — объем раствора, используемый для второго разведения, см3; 1550 — удельный показатель поглощения 1 %-ного раствора витамина А в абсолютном спирте при длине волны 326 нм. 1 мг витамина А соответствует 2,9 тыс. ME.
Приготовление основных и градуировочных растворов. Для приготовления основного раствора витамина А берут навеску масляного препарата, необходимую для получения раствора с активностью 600 МЕ/см3, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в изопропиловом спирте, раствор перемешивают и добавляют спирта до метки.
Раствор хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение недели. Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12 000 ME витамина А в 25 см3. Для этого необходимый объем основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см3 и добавляют изопропилового спирта до метки.
Срок годности растворов не более 1 мес. при хранении в емкости с притертой пробкой при температуре 4-10°С.
Основной раствор витамина E готовят из стандартного раствора α-токоферола ацетата. Для этого 0,02 г препарата растворяют в изопропиловом спирте в колбе вместимостью 50 см3, добавляют спирта до метки и перемешивают. Получают основной раствор витамина E концентрации 0,4 мг/см3.
Из основного раствора готовят рабочие градуировочные растворы, содержащие 0,05; 0,1; 0,5; 1; 3; 5 и 7 мг витамина E в 25 см3. Для этого необходимые объемы основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см3 и добавляют изопропиловый спирт до метки.
Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе, каждый раствор хроматографируют 2 раза.
Построение градуировочных графиков. Для построения градуировочного графика по оси абсцисс откладывают содержание витамина А или E в 25 см3 раствора, по оси ординат — среднюю высоту хроматографического пика, выраженную в единицах оптической плотности (е.о.п.) или в миллиметрах.
Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициента наклона (К) по формуле

где X1 — содержание витамина A (ME) или E (мг) в первом градуировочном растворе; hi — высота i-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
Градуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих раствора витаминов A, E следует хроматографировать. Отклонение высоты пика от измеренной в момент построения градуировочного графика (d, %) определяют по формуле

где h1 и h2 — высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
При отклонении более чем на 5% строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам.
Проведение испытания и обработка результатов. Из тщательно перемешанной пробы исследуемого премикса берут навеску с погрешностью не более 0,5 мг, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 25 или 50 см3 и приливают определенный объем раствора для экстракции: при массе навески 2 г — 10 мл, 5 г — 15 мл, 10 г — 20 мл.
Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре 75±1°С в течение 10 мин. Затем колбу отсоединяют от обратного холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры и фильтруют через фильтр с порами размером 10-16 мкм с использованием водоструйного вакуумного насоса. Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Коническую колбу и осадок на фильтре тщательно промывают 2-3 раза небольшими порциями (по 2-3 см3) изопропилового спирта. Раствор в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают.
Полученные экстракты хроматографируют. При возникновении сомнений в правильности выбора пика (по объему или времени удержания), соответствующего витамину А или Е, необходимо в анализируемый экстракт внести небольшое количество одного из градуировочных растворов соответствующего витамина. Объемное соотношение экстракт : раствор витамина равно для витамина А — 10:2, для витамина E — 10:5. Увеличение высоты пика по сравнению с его высотой на хроматограмме, полученной до введения градуировочного раствора в анализируемый экстракт, свидетельствует, что пик выбран правильно.
Для определения содержания витаминов А и E в премик-се проводят две экстракции и каждый экстракт хроматографируют дважды. Находят среднее арифметическое значение высоты пиков и по градуировочному графику или с помощью коэффициента наклона К определяют содержание витаминов (А — в ME, E — в мг). Разделив результат на массу навески (г) получают содержание витаминов в 1 г продукта.
Результат исследования вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных измерений, расхождения между которыми должны быть не более 10% для витамина А и 15% — для витамина E (относительно среднего арифметического); расхождения между двумя результатами, полученными в разных условиях, не должны превышать 15% для витамина А и 20% — для витамина Е.
Метод нормально-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность метода заключается в омылении навески премикса водно-спиртовым раствором гидроксида калия, экстракции витаминов А, В, E гексаном с последующим определением содержания витаминов на жидкостном хроматографе.
Метод применим в диапазоне концентраций витамина А от 10 до 10 000 МЕ/г, витамина В — от 40 до 10 000 МЕ/г, витамина E — от 10 до 10 000 МЕ/г.
Аппаратура: хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором; колонка для хроматографии стеклянная или металлическая высотой 150 мм и диаметром 3 мм; спектрофотометр со спектральным диапазоном 186-1100 нм.
Приготовление растворов:
1. 10%-ный водно-спиртовый раствор гидроксида калия. Непосредственно перед использованием растворяют 20 г гидроксида калия в смеси из 20 см3 воды и 180 см3 этилового спирта.
2.Стандартные растворы витаминов. Для приготовления стандартного раствора витамина А берут навеску (лучше на часовом стекле) масляного раствора препарата, необходимую для получения раствора с активностью витамина 10 000 МЕ/см3, переносят ее в мерную колбу вместимостью 25 см3 и растворяют в изопропиловом спирте. Раствор перемешивают и доводят до метки спиртом. Хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение недели.
Стандартный раствор витамина D2 готовят из кристаллического эргокальциферола. Для этого содержимое ампулы с препаратом (0,1 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют изопропилового спирта до метки и перемешивают. Из полученного раствора берут 1 см3 и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки спиртом и перемешивают. Готовый раствор содержит 800 МЕ/см3 витамина D2, хранится в плотно закрытой стеклянной посуде в холодильнике.
Для приготовления стандартного раствора витамина E навеску масляного препарата а-токоферола ацетата массой 0,05 г переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, растворяют в изопропиловом спирте, добавляют спирта до метки и тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в емкости с притертой пробкой в течение недели.
Из стандартных растворов готовят контрольные образцы для хроматографирования. Для этого в конические колбы вместимостью 250 см3, снабженные обратным холодильником, помещают 1 см3 раствора эргокальциферола, 0,25 см ретинола ацетата или 0,2 см3 а-токоферола ацетата.
Добавляют 0,1 г гидрохинона (антиоксидант), 30 см3 10%-ного водно-спиртового раствора гидроксида калия и подвергают омылению в течение 30 мин на водяной бане при температуре 85°С. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды, добавляют 30 см3 дистиллированной воды и 30 см3 гексана. Полученную смесь тщательно перемешивают и сливают в делительную воронку вместимостью 200 см3.
После разделения нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексановый слой оставляют в делительной воронке. Экстракцию гексаном водно-спиртовой фазы в конической колбе проводят еще 2 раза, каждый раз сливая в делительную воронку гексановый слой.
Гексановые вытяжки объединяют и промывают в делительной воронке дистиллированной водой порциями по 30 см3 до нейтральной реакции (по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переливают в сухую перегонную колбу через бумажный фильтр и безводный сульфат натрия (40-50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают свежими порциями гексана (20-30 см3).
Все гексановые растворы объединяют и помещают в колбу роторного испарителя при температуре 70°С для отгонки гексана. Сухой остаток растворяют в 3 см3 гексана и переносят в мерную пробирку с притертой пробкой. Раствор может храниться в темном месте при температуре 4-8°С.
Подготовка растворителей. Очистку растворителей, применяемых в хроматографии, проводят путем перегонки, отбрасывая первую и последнюю фракции, составляющие 1/10 от первоначального объема, или пропусканием через колонку, заполненную активированным оксидом алюминия.
Оксид алюминия активируют нагреванием в течение 1 ч при температуре 400-450°С. Колонку высотой 60-80 см и диаметром 2 см заполняют 80 г активированного оксида алюминия и пропускают через нее 700 см3 растворителя.
Для проверки чистоты растворителя его загружают в колонку в объеме 0,05 см3. В случае загрязнения на хроматограмме появляются пики, соответствующие времени удержания витаминов А, В, Е.
Подготовка проб. Навеску премикса массой 10 г взвешивают с погрешностью не более 0,5 мг, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, снабженную обратным холодильником. Добавляют 0,1 г гидрохинона, 50 см3 водно-спиртового раствора гидроксида калия и подвергают омылению на водяной бане при температуре 82-85°С в течение 30 мин.
Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, добавляют 50 см3 дистиллированной воды и 50 см3 гексана, смесь тщательно перемешивают и дают отстояться. После расслаивания смеси гексановую фазу осторожно сливают в делительную воронку вместимостью 500 см3.
Экстракцию гексаном повторяют дважды порциями по 50 см3, последнюю фракцию переносят в делительную воронку через воронку с марлевым фильтром. Остаток на марле слегка отжимают стеклянной палочкой и выбрасывают. Воронку обмывают дистиллированной водой (около 50 см3), собирая смывы в делительную воронку. Гексановые вытяжки в делительной воронке промывают дистиллированной водой порциями по 50 см3 до нейтральной реакции (по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу через обезволенный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия (около 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см3 гексана. Отгоняют гексан на испарителе при температуре 70°С. Сухой остаток растворяют в 3 см3 гексана (добавляют порциями), чтобы перенести в предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой.
Полученный экстракт используют для хроматографического анализа.
Подготовка хроматографа к работе осуществляется в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
Проводят заполнение насоса элюентом. В качестве подвижной фазы используют смесь гексана с этанолом в соотношении 99,5:0,5 по объему. Устанавливают скорость элюирования, соответствующую эффективности колонки, — от 0,5 до 2 см3/мин. При определении витаминов А и E устанавливают длину волны 289 нм, витамина D — 254 нм.
После промывания колонки элюентом регистрирующий прибор должен показывать нулевую линию без дрейфа нуля. В целях повышения чувствительности и точности измерений для каждого прибора подбирают оптимальные условия хроматографирования.
Проведение анализа и обработка результатов. В колонку последовательно вводят от 0,003 до 0,020 см3 исследуемого раствора, стандартного раствора витамина А и стандартного раствора витамина Е. С помощью фотометрического детектора получают хроматограммы при длине волны 289 нм.
Затем устанавливают длину волны 254 нм и при этих условиях снимают хроматограммы для растворов анализируемой пробы и стандарта витамина В.
С помощью металлической линейки измеряют высоту хроматографических пиков, соответствующих витаминам А, В и Е, в анализируемой и стандартных пробах.
Содержание (XF,E) витаминов А (МЕ/г) и E (мг/кг) рассчитывают по формуле

где Q — содержание витамина A (ME) или E (мкг) в стандартном растворе; V1 — объем мерной колбы, взятой для приготовления стандартного раствора, см3; V2 — объем стандартного раствора, взятого на омыление, см3; Vx, VСТ — объем экстракта пробы и стандарта соответственно после подготовительных операций (омыление и пр.), см3; Vix, Fct — объем раствора пробы и стандарта соответственно, внесенных в колонку, см3; hx, hCT — высота пика витаминов на хроматограмме премикса и стандартного раствора соответственно, мм; m — масса навески премикса, г.
Содержание витамина D2 (ХА,Е, МЕ/г) рассчитывают по формуле

где Q — содержание витамина D2 в стандартном растворе, ME; V1 — объем колбы, взятой для приготовления стандартного раствора, см3; V2 — объем стандартного раствора, взятого для последующего разбавления, см3; V3 — объем стандартного раствора после первого разведения, см3; V4 — объем стандартного раствора, взятого на омыление, см3; Vx, FCТ — объем экстракта пробы и стандарта соответственно, внесенных в колонку, см3; Vix, ViСТ — объем экстракта пробы и стандарта соответственно после подготовительных операций, см3; hx, hСТ — высота пиков витамина D2 на хроматограммах премикса и стандарта соответственно, мм; m — масса навески премикса, г.
Результат вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух или более параллельных определений, расхождения между которыми не должны превышать 10% относительно среднего арифметического.
Расхождение между результатами двух измерений, выполненных в разных условиях, не должно превышать 20% относительно среднего арифметического.

---

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Добавить