Новости

Метод срезов

11.01.2014

При ознакомлении с типами бактериальных болезней прежде всего обращают внимание на внешние признаки заболевания: наличие пятен, их характер, форму, цвет и другие морфологические признаки, загнивание тканей, их разрастание и др.
Наряду с макроскопической картиной заболевания большое вспомогательное значение могут иметь и микроскопические препараты, изготовленные из различных органов больного растения. Микроскопические препараты готовятся в основном двумя путями:
- через пораженную ткань пластинки листа, черешка, коры ветвей и стволов или другого органа производится тонкий срез, который затем рассматривается под микроскопом;
- если имеют дело с загнившими корнеплодами, плодами, мокрой гнилью стеблей, корней, то комочки разложившейся ткани эмульгируют в капле стерильной воды и рассматривают затем под микроскопом.
Методика приготовления срезов заключается в том, что скальпелем или ножницами из пораженной ткани вырезается прямоугольный кусочек, размером 4–9 мм2, с хорошо заметными признаками болезни. Такой кусочек закладывается в бузину или сердцевину подсолнечника. Бузина для защемления надрезается вдоль на 2–3 см безопасной бритвой и в этот надрез вставляется кусочек ткани. Срез производится бритвой под углом 45°. Через пораженные стебли или корни травянистых растений срезы делаются непосредственно с ткани перпендикулярно к длинной оси объекта.
Срезов надо делать по несколько с одного места, чтобы иметь возможность выбрать наиболее удачный. Для того чтобы лучше рассмотреть бактерии в пораженной ткани, применяют метод прижизненной окраски водными растворами метиленовой сини (1:10000–1 : 500 000). Препарат, изготовленный обычным способом, помещают в каплю воды на предметном стекле и добавляют каплю метиленовой сини. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Бактерии в тканях окрашиваются в синий цвет и благодаря этому становятся более заметными под микроскопом.
В некоторых случаях, например при наличии бактериального рака томатов, окрашивают фиксированный уже материал по Граму. Такие срезы можно готовить из пораженных стеблей, с потемневшей сосудистой системой, вырезая из нее небольшие кусочки с пораженными участками. Затем бритвой или скальпелем делают продольные срезы или соскобы и раскладывают все это на предметном стекле в капле воды. Из мякоти плода или плодоножки, где имеются пятна, также делают срезы или соскобы на предметные стекла в капле воды, подсушивают их в термостате или на открытом воздухе. Затем фиксируют, трехкратно проводя через пламя горелки. После охлаждения заливают спиртом и оставляют на воздухе до полного его испарения, после чего окрашивают по Граму. Окрашивание препаратов проводят следующим образом. Приготовленные стекла накрывают полосками фильтровальной бумаги, окрашенной гинциан- или кристалл-виолетом, и смачивают водой таким образом, чтобы она была равномерно распределена по всей поверхности бумажки. В таком виде препарат нагревают на пламени горелки до появления паров, после чего оставляют препарат на 1–2 мин. По истечении указанного срока бумажку осторожно снимают пинцетом, сливают избыток краски и, не промыв, заливают раствором Люголя на. 1–2 мин. Затем раствор Люголя сливают и препарат обрабатывают 96%-ным спиртом. На обесцвечивание спиртом необходимо обращать особое внимание, так как при недостаточном промывании могут оставаться окрашенными даже те бактерии, которые обычно не красятся по Граму, а при избыточном – могут обесцвечиваться и грамположительные бактерии. Чтобы этого не произошло, в спирт прибавляют 10%-ную настойку йода (1–2 мл на 50 мл спирта). Этим спиртом промывают препарат до тех пор, пока не перестанут отходить струйки краски, а последние капли не будут бесцветны. Надо следить также за тем, чтобы по краям стекла не было краски, стирая ее кусочком фильтровальной бумаги. Не следует прикасаться пальцами, загрязненными краской, к промывному спирту, так как последние капли в этом случае не будут бесцветными. После обработки препаратов спиртом их промывают дистиллированной водой, докрашивают в течение 5–10 сек фуксином Пфейфера (фуксин Циля, разведенный 1 : 10), снова осторожно промывают водой, высушивают и просматривают под микроскопом под иммерсией. В каждом препарате просматривают примерно 20 полей зрения. Если исследуемый материал заражен возбудителем бактериального рака томатов С. michiganense, то под микроскопом можно увидеть мелкие окрашенные в фиолетовый цвет палочки указанной бактерии. Особенно много таких бактерий бывает в сосудах, в которых они лежат густой черной массой, заполняя просвет сосуда. Для сравнения хорошо иметь препарат, приготовленный из чистой культуры С. michiganense или из заведомо пораженных тканей.
Для дифференцирующей окраски здоровых и пораженных тканей и бактерий применяется окраска сафранином и анилин-бляу. Методика окраски такова: приготовленный препарат окрашивают 1%-ным водным раствором сафранина в течение 1,5–2 мин, затем обесцвечивают 30–90%-ным спиртом. После этого докрашивают в течение 0,5 мин анилин-бляу. Для приготовления краски анилин-бляу берут 25 мл насыщенного раствора краски и 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты. При просмотре препарата под микроскопом видны на общем розовом фоне пораженной ткани окрашенные в синий цвет скопления бактерий в виде темно-синей массы.


Имя:*
E-Mail:
Комментарий: