При изучении различных типов бактериальных болезней выявление и анализ анатомических изменений, которые вызывает возбудитель бактериоза при внедрении и размножении в тканях растения, играют иногда очень существенную роль.
В некоторых случаях картина гистологических изменений в тканях бывает настолько характерной, что дает возможность сделать вывод не только об этиологии заболевания, но и о видовой принадлежности возбудителя болезни. Вот почему применение анатомического метода при изучении бактериозов растений и их возбудителей имеет несомненное и важное значение.
Анатомические срезы могут готовиться из свежего и фиксированного материала.
Из свежих образцов больных растений срезы делают от руки бритвой, помещают в каплю глицерина и просматривают под микроскопом в неокрашенном виде либо после окраски их метиленовой синью, рутеньевым красным, Суданом III и концентрированным раствором генцианового фиолетового.
Обработка материалов для получения постоянных препаратов и изготовления микротомных срезов проводится по довольно сложной методике. Эта методика подробно изложена в «Основах ботанической микротехники». Здесь мы лишь вкратце приведем описание отдельных манипуляций в порядке последовательности работ.
На рис. 28 показан микротом, изготовленный на Харьковском заводе.

Отобрав соответствующие образцы растений, подлежащих в дальнейшем анатомическому исследованию, и вырезав из них нужные кусочки, подвергают их действию фиксации. Это дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте и сохранить неизмененной тонкую структуру его клеток. Для этой цели в литературе описано значительное количество различных методов. Однако наиболее пригодными в качестве фиксатора оказались многочисленные химические вещества, входящие в состав тех или других фиксирующих смесей. Существуют определенные приемы, которыми следует руководствоваться при проведении фиксации объектов. Прежде всего фиксировать необходимо живой материал, не подвергавшийся никаким случайным воздействиям. Поэтому фиксировать его целесообразно на месте произрастания растений, взяв с собой запас склянок с фиксатором. Никогда не следует фиксировать крупные объекты. Желательно нарезать кусочки таким образом, чтобы они имели форму куба со сторонами 2–3 мм, а для плоскостных объектов – форму прямоугольника со сторонами не более 2–3х2–4 мм. Вообще объекту желательно придавать наиболее удобную форму, сообразуясь со строением органа и той целью, для которой ведется исследование. Небольшой размер фиксируемого объекта объясняется тем, что в такие объекты проникает фиксатор более равномерно, пропитывая все его части.
Количество фиксирующей жидкости должно превышать в 50–100 раз сумму фиксируемых объектов. Этим достигается равномерность и однородность действия состава и устраняется опасность истощения его, благодаря поглощению тканями объекта и разбавлению соками растения. Раз в сутки полезно заменять состав новым.
Практика показывает также, что более слабые растворы являются более эффективными, хотя срок фиксации при этом удлиняется.
Необходимым и очень важным моментом при фиксации является удаление воздуха из объекта. Для этой цели можно воспользоваться водоструйным насосом или насосом Комовского, присоединяя их к сосуду с фиксатором. Если насоса нет, то можно применить энергичное встряхивание склянки с фиксатором с помещенными в ней объектами или накрыть их кусочком ваты, которая, намокая, увлечет их на дно сосуда. Хорошо помещать срезы для вытеснения воздуха в холодную или только что прокипяченную воду, в которой воздух объекта растворяется, а проще – готовить фиксатор на такой воде.
Во избежание неточности при объяснении микроскопической картины желательно применение двух и более фиксаторов, чтобы иметь возможность сравнить результаты. Вместо извлечения объектов из фиксирующей жидкости лучше переливать фиксатор с ними из одной банки в другую.
В литературе имеется значительное количество рецептов фиксирующей жидкости, но здесь мы приведем лишь два из них.
1. Спирт с формалином: спирт – 70 мл, вода – 25 мл и формалин – 5 мл.
Эта смесь является наиболее Простой и дешевой, но в то же время представляет собой отличный фиксатор для анатомических работ. Срок действия этого состава не ограничен. После него не требуется производить промывку объекта, а также переносить его в какую-либо жидкость для дальнейшего хранения, так как сам состав является хорошей консервирующей жидкостью.
2. Фиксатор Навашина: хромовая кислота 1%-ная – десять частей, формалин 40%-ный – четыре и уксусная кислота (ледяная) – одна часть.
Срок пребывания в фиксаторе длится три–пять дней. После фиксации объекты промывают в проточной водопроводной воде (за исключением того случая, когда применяется спирт с формалином) в течение суток. Наиболее простым устройством для промывки фиксированного материала является банка, затянутая сверху марлей и поставленная под кран. Для промывки служат также специальные фарфоровые цилиндры с плоским или выпуклым дном, причем дно и большая часть боковой поверхности цилиндрика имеют отверстия диаметром 1 мм. Такие цилиндрики с заложенным в них фиксированным материалом, закрытые пробкой, опускаются в ведро или другой сосуд, поставленный под кран. Цилиндрики можно заменять небольшими отрезками широкой трубки от 1,5 до 4 см диаметром и от 5 до 10 см длиной, оба конца которой затягиваются марлей либо шелковым газом после помещения в них объектов. Промывку можно проводить также в марлевых салфеточках.
Промытый материал обезвоживают, постепенно заменяя воду спиртом и последовательно перенося объект в спирты все повышающейся концентрации. При этом чем больше ступеней будет заключать ряд спиртов возрастающей концентрации от 0 до 100%, тем равномернее и плавнее пойдет замещение воды спиртом, тем меньше будет нарушений физических свойств в объекте. На практике применяется обычно пять-шесть ступеней для более грубой работы и 10–12 для более тонких исследований. Спирты подбирают обычно таким образом:

Спирты различной концентрации можно приготовить из 90 и 96%-ного спирта, исходя из данных, приведенных в табл.

Следует отметить, что различные концентрации спиртов готовятся обычно из 95%-ного или другого водного раствора спирта. Для целей микротехники удобным путем получения абсолютного спирта является обезвоживание 95–96%-ного спирта.
Его готовят таким образом. Кристаллический медный купорос измельчают в ступке и прокаливают в фарфоровой чашке, помешивая его стеклянной палочкой до тех пор, пока купорос не обратится в белый аморфный порошок. После того как он остынет, его засыпают в бумажные гильзы из трех слоев фильтровальной бумаги (рис. 29) и крепко завязывают их концы.

На 1 л спирта необходимо брать по две гильзы, содержащих по 100 г безводного купороса каждая. Через три-четыре дня гильзы следует заменить новыми. Сменять гильзы в банке со спиртом необходимо три раза в течение десяти дней. После этого положить в банку новую пару гильз и оставить их до тех пор, пока не будет использован весь абсолютный спирт.
Процесс обезвоживания объекта удобно производить в посуде емкостью не меньше 150 мл с содержанием в ней не менее 100 мл спирта. Что касается срока пребывания объекта в спиртах, то на этот вопрос ответить трудно, так как многое зависит от величины объекта, его плотности, проницаемости и др. Общие указания сводятся к тому, что объекты средней твердости и величины следует выдерживать один- два дня в каждом из спиртов; мелкие и нежные частички можно оставлять в спирте на 2–4 час, а плотные или крупные объекты – на два-три дня.
Однако согласно практике некоторых лабораторий достаточно взять четыре ступени спирта (не считая абсолютного), выдерживая объект в каждом из них по 2 час. В абсолютном спирте целесообразно выдерживать двойной срок, для чего удобно иметь две банки с абсолютным спиртом.
Обезвоживание следует начинать с более низких концентраций, например с 30%, переходя к более высоким – к 50, 75 и 85%, а затем к абсолютному спирту.
Из абсолютного спирта образцы переносят в толуол: сначала на трое суток в смесь толуола со спиртом – первые сутки 2/3 части абсолютного спирта и 1/3 толуола, вторые – 1/2 абсолютного спирта и 1/2 толуола, третьи – 1/3 абсолютного спирта и 2/3 толуола и на четвертые сутки – в чистый толуол, в котором образцы выдерживаются сутки.
Из толуола образцы помещают в бюксики с новой порцией толуола, куда добавляют небольшой кусочек (с горошину) парафина. Постепенно растворяясь, парафин проникает в объект. Через сутки снова добавляют небольшое количество парафина и так поступают в течение двух-трех дней, затем объект в растворе парафина выдерживают при температуре 35–40° С, постепенно добавляя парафин в толуол еще в течение двух-трех дней. После этого крышки бюксиков открывают и парафинированные образцы выдерживают в течение четырех–шести дней при температуре плавления парафина (55–57°С) до исчезновения толуола. Из бюксиков парафинированные образцы переносят в жидкий чистый парафин и выдерживают в термостате при температуре, на 0,5–1° С превышающей температуру плавления парафина. Срок пребывания в парафине зависит от плотности, величины и проницаемости образцов. Но главная его цель заключается в том, чтобы добиться полного пропитывания парафином всех частей объекта. Лишь после этого можно приступить к заливке объектов парафином. При этом могут применяться в качестве посуды предварительно смазанные глицерином акварельные ванночки, часовые стекла, небольшие тигли, выпарительные чашки и другие мелкие стеклянные или фарфоровые сосудики, а также небольшие бумажные коробочки и, наконец, раздвижные рамочки. Важно, чтобы из всех этих приборчиков можно было легко вынуть затвердевший парафин. Из акварельных ванночек парафин при погружении в воду всплывает сам.
Заливку производят на специальном нагревательном столике (рис. 30) либо в парафиновой бане. Из кастрюльки со свежим парафином нужной температуры плавления наливают некоторое количество парафина в акварельные ванночки или другой приборчик, заполняя их до краев. Затем нагретым пинцетом переносят кусочек материала в ванночку, стараясь установить его там в нужном положении, на нужной глубине. После того как на поверхности ванночки образуется толстый и прочный слой затвердевшего парафина, ее погружают под поверхность холодной воды. При этом парафин очень быстро отрывается от ванночки и всплывает на поверхность воды, где его следует еще оставить в течение получаса. В виде заливок или блоков материал можно хранить довольно долго без порчи.

Чтобы подготовить материал для резки на микротоме, из таких заливок готовят блоки (рис. 31), удаляя тонкой бритвой вокруг объектов лишний парафин и оставляя с каждой стороны слой в 2–3 мм, затем блоки при помощи парафина наклеивают на предварительно прокипяченные в парафине деревянные прямоугольные призмочки величиной 3х2х1,5 см. Наклеивать блок, а затем помещать его в микротом надо таким образом, чтобы его длинная сторона была параллельна ножу, а узкая – перпендикулярна.

Правильная установка микротома и тщательная заливка объектов гарантируют получение непрерывной ленточки срезов нужной толщины и без пробелов. Ленточки микротомных срезов нижней блестящей стороной размещают на предметном стекле в капле воды в порядке их получения. Чтобы срезы окончательно расправились, стекло с водой можно слегка подогревать на пламени спиртовой горелки, но ни в коем случае не доводить парафин до плавления. Пока срезы расправляются, приходится их направлять и удерживать в нужном положении при помощи акварельной кисточки. Затем воду сливают с угла стекла, касаясь его фильтровальной бумагой, а срезы плотно пристают к стеклу. После этого препарат выдерживают еще в сухом теплом месте, например на термостате, в течение 12– 24 час. Срезы настолько плотно приклеиваются к стеклу, что при дальнейшей обработке они не смываются. Срезы можно приклеивать и при помощи альбумина Мейера, приготовленного следующим образом: 2–3 г сухого куриного белка растирают в ступке до тонкого порошка, затем по каплям добавляют воду, Продолжая растирать белок. Когда он весь растворится, прибавляют еще 100–200 мл чистой воды, 5 мл глицерина и кристаллик карболовой кислоты или тимола. Каплей этого раствора натирают чистым пальцем вынутые из спирта и обсушенные стекла так, чтобы не было избытка. После окончательного подсыхания стекол на них наносят воду и поступают так, как при наклейке срезов водой.
Состав раствора для наклейки срезов готовят еще и таким образом: смешивают один взбитый куриный белок и столько же по весу глицерина с добавлением фенола. Перед употреблением 15 капель этой смеси добавляют к 50 мл воды и этим раствором намазывают стекла.
Дальнейшим этапом работы является освобождение срезов от парафина. Это осуществляется путем погружения стекол в ксилол или хлороформ. Парафин быстро растворяется, и срезы становятся прозрачными. При этом желательно применять две смены ксилола или хлороформа, выдерживая срезы в каждой по 5 мин. Для удаления парафина можно помещать срезы на сутки в толуол. После этого часть препаратов, которые желательно просмотреть под микроскопом неокрашенными, заключают в бальзам.
Остальные препараты окрашивают.
Приводим описание наиболее часто применяющихся методов окраски препаратов. На рис. 32 показаны ванночки для окраски и промывки препаратов.

Окраска по методу Стоутона (для микротомных срезов). Срезы проводят по нисходящей серии спиртов следующим образом.
1. Толуол I; толуол II; смыть абсолютным спиртом; спирт 95%-ный, 85%-ный, 75%-ный, 50%-ный, 30%-ный и 10%-ный; дистиллированная вода.
2. Окраска тионином. На стекла (препараты) наливают на 1 час тионина (тионина 0,1 г, 5% раствора фенола в 100 мл дистиллированной воды). Затем сливают краску, обсушивают фильтровальной бумагой. (Препараты можно помещать в краску.)
3. Препараты проводят через восходящий ряд спиртов: 10, 30, 50, 75, 85, 95°-ный и абсолютный. Абсолютный спирт наливают два раза на препарат и сливают.
4. После этого красят оранж G (готовится насыщенный раствор) в абсолютном спирте. Краску оранж G не болтают, наливая на срез и затем сливая ее (смотрят в микроскоп, чтобы окраска из синей стала зеленоватой). Красят 3–5 мин. Промывают абсолютным спиртом (налить и слить).
5. Промывают толуолом (налить и слить два раза).
6. Заключают в канадский бальзам.
Результаты окраски такие: бактерии окрашиваются в фиолетово-пурпуровый цвет, клетчатка – в желтый или зеленый; древесина – в синий; ядра – в голубой; ядрышки и хромосомы – в темно-синий, ахроматиновые элементы – в пурпуровый.
Окраска для свежих срезов по Стоутону (сделанных от руки). Срезы поместить в воду, обработать тионином 5 мин (0,1 г тионина, 5% раствора фенола в 100 мл дистиллированной воды), промыть водой, затем обработать 95%-ным спиртом, оранжем G (насыщенный раствор в абсолютном спирте) – 3–5 мин (для дифференциации), промыть абсолютным спиртом, для просветления использовать ксилол или толуол и заключить в канадский бальзам.
Контролировать окраску можно под микроскопом, срезы должны быть однородно желто-зеленого цвета.
Окраска препаратов методом проф. Оксиюка. Препараты из толуола переносят на 2–3 час в 96°-ный спирт, а затем на 10–15 мин в воду. Из воды погружают в раствор фуксина (260 мг фуксин-пара для фуксин-сернистой кислоты, растворенной в 100 мл дистиллированной воды) на 1–2 час, затем вновь на 10–15 мин в воду и далее на 1 час в 96°-ный спирт. После этого препараты еще раз промывают несколько секунд в абсолютном спирте и подвергают повторной окраске тионином в течение 15–20 мин (тионин приготовляется на анилиновом масле). Окрашенные препараты вначале опускают на несколько секунд, а затем на 12 час в толуол. После этого на объект наносят каплю канадского бальзама и препарат накрывают покровным стеклом.

---

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Добавить