Выделение возбудителя бактериоза может быть произведено из любого, пораженного бактериозом, органа растения. На практике при этом может применяться три метода: стерилизация поверхности пораженных тканей химическими веществами – сулемой, формалином, азотнокислым серебром и др.; проведение пораженного образца через огонь (фламбирование); без обработки, но с применением механической очистки. Оценивая по достоинству каждый из указанных методов, следует заметить, что не все они могут быть использованы во всех без исключения случаях. Поэтому при выборе метода необходимо принимать во внимание характер материала, подлежащего исследованию. Так, категорически не рекомендуется дезинфицировать такие нежные части растения, как листья, цветы, травянистые стебли и другие им подобные части растений, так как это может привести к гибели имеющихся на них патогенных бактерий. К таким же результатам может привести и проведение образцов через огонь. Но в том случае, когда мы имеем дело с наростами, семенами, хорошо одревесневшими плотными частями стеблей, мясистыми корнями, корнеплодами, возможно и применение двух указанных методов. Наиболее подходящим является третий метод, неоднократно применявшийся с успехом в наших исследованиях. Состоит он в том, что вырезанные из исследуемого образца небольшие кусочки пораженной ткани (при обязательном захвате при этом здоровой) подвергают действию текучей струи водопроводной воды в течение 15–20 мин. Затем этот кусочек тщательно ополаскивают стерильной водопроводной водой и помещают в стерильную чашку Петри, используя его в дальнейшем для бактериологического посева. На рис. 33 показан инвентарь, применяющийся в бактериологической технике, а на рис. 34 – разливание агара в чашки Петри.

После разлива агара чашки обычно выдерживают некоторое время в сушильном шкафу или термостате при 45° С для удаления образовавшейся конденсационной воды. Описаны и другие способы удаления конденсата. Например, после разлива агара чашки сразу прикрывают кусками стерильной фильтровальной бумаги, размеры которых в полтора-два раза превышают размеры чашки. Конденсат при этом не образуется, агар подсыхает прекрасно, а если всю партию разлитых чашек покрыть еще одним общим листом фильтровальной бумаги, то даже движение воздуха при работе возле чашек не приведет к бактериальному загрязнению агара. Этим методом удобно пользоваться при работе в небольших лабораториях, в палатках, в полевых условиях.
Для предотвращения загрязнения агара воздушной флорой при отсутствии лабораторного бокса предлагается метод стерильного разлива при ультрафиолетовом облучении. Заключается он в следующем. Ставят растапливаться агар. Одновременно включают источник ультрафиолетового излучения – ртутно-увиолевую лампу, 80–90%-ный поток радиации которой имеет длину волны 253 А; трубка ее находится в 30 см над поверхностью стола. К моменту, когда агар растопится, лампа работает на полную мощность. Под лампой устанавливается нужное количество открытых стерильных чашек Петри, в которые разливают агар. Через 25–30 мин чашки закрывают, затем выключают лампу. Во время работы для защиты глаз лаборанты одевают очки-консервы, а для защиты рук – хирургические перчатки.
Описано несколько методов посева образцов больных растений на питательные среды для извлечения из них возбудителя бактериоза.
Наиболее известны такие: посев растертой кашицы из образца по поверхности питательного агара; посев растертой кашицы в жидкую питательную среду для накопления в ней возбудителя; раскладывание зараженных кусочков ткани на поверхности питательного агара (метод обрастания); метод изоляции на твердых питательных средах, подкрашенных анилиновыми красками (малахит-грюн, генциан-виолет, кристалл-виолет), задерживающих рост спороносных бактерий; метод изоляции на средах с добавлением двухромовокислого калия (К2Сr2O7) для задержки роста грамотрицательных бактерий; посев соков растений, взятых шприцем из его сосудов; посев образцов, взятых из увядших и разрезанных сосудов растений, проведение ими по поверхности питательных сред; мацерация кусочка пораженного образца плода в капле воды и наблюдение за появлением бактериального экссудата с дальнейшим его посевом на питательные среды.
Методика приготовления кашицы из кусочка ткани пораженного образца такова: после соответствующей предварительной обработки такой кусочек помещают в стерильную ступку и растирают его стерильным пестиком в капле стерильной водопроводной воды. После этого предварительно прокаленной на огне горелки платиновой петлей набирают небольшое количество материала и переносят его в чашку Петри на поверхность питательного агара, тщательно растирая его по всей поверхности чашки шпаделем Дригальского (рис. 35), либо засевая ее густыми штрихами при помощи петли от одного края чашки до другого. Для получения более редкого посева тем же шпаделем проводят по поверхности второй и третьей чашки. Что касается посева, сделанного петлей, то при тщательной заштриховке удается получить достаточное количество изолированных колоний, что освобождает от посева в добавочные чашки.

Необходимо отметить, что метод накопления в жидкой питательной среде и метод обрастания наложенных на средах кусочков не могут дать четких результатов, так как при таком близком контакте неизбежно будет проявляться влияние на возбудителя бактериоза сопутствующей микрофлоры. В том случае, когда это влияние будет антагонистическим, возбудитель заболевания может не развиться на среде.
При выделении фитопатогенных бактерий имеют место и такие случаи, когда на средах не удается выделить возбудителя заболевания. Это наиболее часто наблюдается при изолировании возбудителей бактериозов плодовых растений, особенно Е. amylovora. В таких случаях Биллинг, Кроссе и Гарретт (1960) рекомендуют провести искусственное заражение незрелых плодов груш и после появления на них капель молочного экссудата, что специфично только для Е. amylovora, произвести посев этих капель на питательные среды для изолирования культуры. Эти же авторы предлагают и такую методику выделения Е. amylovora. Необходимо выбрать подходящий материал из пораженного образца и мацерировать его в капле воды, наблюдая за появлением бактериального экссудата. Затем одну петлю суспензии высеять на пептонно-дрожжевой агар или агар с сахарозой.
При выделении фитопатогенных бактерий из семян в литературе рекомендуется подвергнуть их предварительной дезинфекции, главным образом сулемой. Однако такая рекомендация может быть правильной только в том случае, если имеется в виду выделение бактерий из внутренних тканей семян. Но даже и в этом случае сулема не всегда может оказаться пригодной, так как известны случаи обеззараживания под ее действием и внутренних тканей. Формалин в данном случае может иметь преимущество.
В практике нашей лаборатории семена обычно подвергали обработке текучей водопроводной водой в течение 15–20 мин, а затем их тщательно пять-шесть раз ополаскивали стерильной водой. Этот прием оказался настолько эффективным, что практически, особенно на семенах с гладкой кожурой, почти не оставалось бактериальной инфекции. Затем из таких семян вырезали пораженные участки, растирали в стерильной ступке и полученную кашицу высевали в чашки Петри на питательные среды.
Дезинфицировать, как мы уже указывали, можно лишь плотные одревесневшие ткани корней, стеблей, опухоли и наросты на корнях и стволах. После этого из них вырезают небольшие кусочки, а затем уже применяют описанную методику посева.

---

Имя:*
E-Mail:
Комментарий:

Добавить